山羊肺泡巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

吉小芳，俞慧清，岳亮亮，徐旭俊，陳建泉，成國祥，劉宗平

技術(shù)方法

山羊肺泡巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

吉小芳1,2，俞慧清1*，岳亮亮1,3，徐旭俊1，陳建泉1，成國祥1，劉宗平2

巨噬細(xì)胞是機(jī)體造血系統(tǒng)中可塑性較強的細(xì)胞，存在于機(jī)體的多個組織中，并且具有強大的功能多樣性。巨噬細(xì)胞具有吞噬和消化病原體、感染細(xì)胞及死亡細(xì)胞碎片、募集和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞參與炎性反應(yīng)及幫助組織修復(fù)等功能[1,2]。當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時，血液中的單核細(xì)胞在趨化因子的引導(dǎo)下，進(jìn)入抗原侵入的局部組織，進(jìn)一步分化成各類炎癥巨噬細(xì)胞。

肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原微生物侵襲肺臟的第一道防線，接觸到致病因子后，肺泡巨噬細(xì)胞伸出偽足將其包圍形成封閉小體，與細(xì)胞內(nèi)大的溶酶體融合，達(dá)到殺死致病因子的目的。但有一些致病因子在進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了抵御機(jī)體免疫的機(jī)制，如結(jié)核桿菌中的硫酸鳥苷酯可抑制巨噬細(xì)胞中吞噬體與溶酶體結(jié)合，使結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞中長期生存[3]。另一方面，肺泡巨噬細(xì)胞還參與特異性免疫[4,5]，對抗原進(jìn)行加工提呈，分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、啟動炎性反應(yīng)，是研究肺部感染的重要細(xì)胞模型。

目前，已有關(guān)于小鼠、豬、牛等巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的報道[6-9]，但關(guān)于山羊肺泡巨噬細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)仍有待充實。本研究旨在前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合肺氣管灌洗及密度梯度離心，從山羊肺臟中獲得高純度、高活性的肺泡巨噬細(xì)胞，為深入研究巨噬細(xì)胞的生物特性和抗胞內(nèi)菌的免疫功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

山羊由上海轉(zhuǎn)基因研究中心實驗羊牧場提供，本研究方案獲得上海轉(zhuǎn)基因研究中心動物倫理委員會批準(zhǔn)[No.G2016-05]；羊外周血單核細(xì)胞分離液、羊巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基均購自天津市灝洋生物制品科技有限公司；胰酶、小牛血清均購自GIBCO公司；臺盼藍(lán)、4%多聚甲醛等均為國產(chǎn)分析純試劑；雞紅細(xì)胞從家雞靜脈取得,與Alseveve液按1∶4比例混合于4度保存?zhèn)溆茫蝗鹗?姬姆薩復(fù)合染液購自上海歌凡生物科技有限公司，熒光標(biāo)記抗羊CD14抗體(ab186689)購自于Abcam公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞檢測委托上海張江公共服務(wù)平臺進(jìn)行。

1.2 實驗方法

1.2.1 山羊肺巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

采取新鮮山羊肺臟，將肺臟提起保持不動，結(jié)扎氣管，用200 mL無菌PBS通過氣管沖洗肺臟內(nèi)部，每次50 mL，重復(fù)4次。沖洗過程中適當(dāng)輕輕按摩肺葉，使肺巨噬細(xì)胞慢慢釋放出來，將含巨噬細(xì)胞的沖洗液收集到入一個預(yù)冷的燒杯中，用雙層無菌紗布過濾除去雜質(zhì)。若濾液混有部分血細(xì)胞，再用外周血單核細(xì)胞分離液處理濾液，具體步驟可參考分離液說明書。簡要地，先向滅菌離心管中依次加入分層試劑A和D，再加入肺泡濾液，使各液面清晰分層，然后離心30 min，小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細(xì)胞層，加入 PBS洗滌兩次，收集細(xì)胞。

懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用預(yù)熱的羊巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到0.5×106個/mL，置于6 cm2的組織培養(yǎng)皿中，于5% CO237℃溫箱培養(yǎng)。1～2 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的淋巴細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率

將0.4%的臺盼藍(lán)染液與等體積細(xì)胞懸液混合，染色2～3 min，取1滴混合懸液于細(xì)胞計數(shù)器內(nèi)。鏡下觀察可見，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，計數(shù)藍(lán)染細(xì)胞和未藍(lán)染細(xì)胞。

1.2.3 肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)特性觀察

細(xì)胞培養(yǎng)后,每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。培養(yǎng)四周后，采用姬姆薩染色，進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 吞噬雞紅細(xì)胞試驗

將分離培養(yǎng)兩小時的細(xì)胞取一部分進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗，約1×105個細(xì)胞懸浮于2 mL培養(yǎng)液中；將5%的雞紅細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌兩次，加入0.5 mL至巨噬細(xì)胞懸液中，混合后將細(xì)胞移置培養(yǎng)皿中，置于5% CO237℃溫箱孵育；1 h后輕輕吹打，收集細(xì)胞。將混合細(xì)胞懸液涂片，晾干后采用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液染色細(xì)胞，具體操作見說明書。染色后細(xì)胞置于顯微鏡下觀察，分析細(xì)胞吞噬情況。細(xì)胞吞噬百分率按以下公式計算: 細(xì)胞吞噬率(%)=吞噬細(xì)胞/(吞噬細(xì)胞+未吞噬細(xì)胞)×100%。1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞純度

體外培養(yǎng)四周后，取部分細(xì)胞用0.25%的胰酶將巨噬細(xì)胞消化下來， 800 rpm離心5 min，用冰冷的PBS洗一次；用1 mL含5% FBS的PBS重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min，800 rpm/min離心5 min；用 200 μL含5% FBS的PBS重懸1×106個細(xì)胞，加入 10 μL 的抗羊CD14抗體，避光孵育1 h。800 rpm離心5 min，去上清，加入1 mL含5% FBS的PBS重懸細(xì)胞，再次離心去上清，重復(fù)3次，最后一次用200 μL含5% FBS的PBS重懸細(xì)胞，實驗設(shè)經(jīng)相同方法處理的肺成纖維細(xì)胞作對照，流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞表面CD14表達(dá)水平，流式檢測委托上海張江公共服務(wù)平臺進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 分離細(xì)胞的培養(yǎng)與形態(tài)觀察

分離的細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色，極少數(shù)細(xì)胞呈藍(lán)染，平均95%以上細(xì)胞均未著色，細(xì)胞形態(tài)飽滿，為狀態(tài)較好的活細(xì)胞。鋪板后兩小時可觀察到不規(guī)則形的細(xì)胞貼滿培養(yǎng)皿，同時也有一些圓形的未貼壁細(xì)胞浮在上面；更換培養(yǎng)基，洗去未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，兩天后可見細(xì)胞有所收縮，體積較小，多數(shù)細(xì)胞伸出較短偽足，形態(tài)變得不規(guī)則，折光性較好(圖1A)；細(xì)胞培養(yǎng)一周,細(xì)胞體積有所增大，貼壁牢固，伸出的偽足多種多樣，呈橢圓形、星形、梭形或不規(guī)則形，胞漿豐富(圖1B)；培養(yǎng)四周后，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，大部分細(xì)胞呈煎蛋狀，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞開始老化(圖1C)。

注：(A)經(jīng)篩選后培養(yǎng)兩天的細(xì)胞，細(xì)胞開始伸出觸角；(B)培養(yǎng)一周的細(xì)胞，細(xì)胞形狀多樣，貼壁牢固，胞質(zhì)豐富，偽足突出；(C)培養(yǎng)四周的細(xì)胞，呈煎蛋狀，胞質(zhì)內(nèi)有空泡；(圖1A，B，C放大倍數(shù)均為×100)。圖1 體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞不同時期形態(tài)圖(Bar=50 μm)Note.(A)Cells cultured for 2 days, stretched out tentacles；(B)Cells cultured for one week, being morphologically diverse, adherent firmly, cytoplasm rich, and with prominent pseudopodia；(C)Cells cultured for 4 weeks, like an omelette,contain vacuoles.Fig.1 Morphology of alveolar macrophages at different stages

圖2 體外培養(yǎng)近一個月的巨噬細(xì)胞經(jīng)姬姆薩染色(×200)Fig.2 Macrophages cultured in vitro for about one month. Giemsa staining.

注：白色箭頭所指為正在吞噬多個紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，灰色箭頭所指為雞紅細(xì)胞。圖3 羊巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞 (瑞氏-姬姆薩復(fù)染，×400)Note. The white arrow indicates a macrophage that phagocytosed many red blood cells. The grey arrow refer to chicken red blood cells.Fig.3 Goat macrophages engulfed chicken red blood cells. Wright-Giemsa stained

將體外培養(yǎng)一個月的巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行姬姆薩染色，可見細(xì)胞著色較深，大小不一，大部分呈煎蛋狀，偽足較短。

2.2 吞噬雞紅細(xì)胞試驗

將分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗，孵育1 h后收集細(xì)胞，采用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液染色，在油鏡下觀察。在細(xì)胞涂片中可見雞紅細(xì)胞的細(xì)胞核染成較深的藍(lán)色，胞漿紫紅色；羊巨噬細(xì)胞整體染成藍(lán)色，細(xì)胞較大。巨噬細(xì)胞吞噬了一個或多個雞紅細(xì)胞，在胞漿中形成吞噬體，雞紅細(xì)胞邊緣被巨噬細(xì)胞溶酶體消化，紅細(xì)胞核染色較深；有些紅細(xì)胞附著在巨噬細(xì)胞周邊，有些已經(jīng)正在被包裹形成吞噬體(圖3)。雞紅細(xì)胞吞噬結(jié)果表明分離的羊肺泡巨噬細(xì)胞具有很強的吞噬作用，計數(shù)200個細(xì)胞，平均54.5%的巨噬細(xì)胞吞噬了或者正在吞噬雞紅細(xì)胞。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞純度

收集體外培養(yǎng)四周的羊巨噬細(xì)胞，并以肺成纖維細(xì)胞作陰性對照，消化后與熒光標(biāo)記的抗羊CD14抗體共孵育，在流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)上檢測山羊肺泡巨噬細(xì)胞CD14表達(dá)水平，結(jié)果見圖4、5。圖4所示，收集的山羊肺泡巨噬細(xì)胞中有93.7%的細(xì)胞表達(dá)了CD14；圖5所示，收集的對照成纖維細(xì)胞中只有0.26%的細(xì)胞表達(dá)了CD14；M1為熒光標(biāo)記陰性區(qū)間，M2為熒光標(biāo)記陽性區(qū)間。實驗表明，本研究經(jīng)體外培養(yǎng)獲得了高純度的巨噬細(xì)胞。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬殺傷、遞呈抗原、啟動免疫應(yīng)答及抗腫瘤等功能[10]，成功分離肺泡巨噬細(xì)胞，對深入了解巨噬細(xì)胞如何抵抗病原體研究提供了重要的材料，有助于對疾病的預(yù)防與控制。

注：(a)流式細(xì)胞收集圖；(b)流式結(jié)果分析圖。圖4 肺泡巨噬細(xì)胞表面CD14表達(dá)情況Note.(a)Flow cytometric map of cell collection；(b)Flow cytometric analysis chart.Fig.4 Expression of CD14 on alveolar macrophages

注：(a)流式細(xì)胞收集圖；(b)流式結(jié)果分析圖。圖5 肺成纖維細(xì)胞表面CD14表達(dá)情況(對照)Note.(a)Flow cytometric map of cell collection；(b)Flow cytometric analysis chart.Fig.5 CD14 expression on the surface of lung fibroblasts(Negative control)

巨噬細(xì)胞分離過程中常會有血紅細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的污染，培養(yǎng)過程中肺成纖維細(xì)胞分裂旺盛，生長快，體外培養(yǎng)很容易成為優(yōu)勢細(xì)胞，從而抑制巨噬細(xì)胞的生長。本研究在用PBS灌注分離肺泡中的巨噬細(xì)胞時，增加了巨噬細(xì)胞分離液密度梯度離心的步驟，根據(jù)巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞及成纖維細(xì)胞密度的微小差異，利用單個核細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，離心后形成多個液面分層，選擇單核細(xì)胞層進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，從而去除了血紅細(xì)胞及肺泡成纖維細(xì)胞的污染，成功獲得了高純度的肺泡巨噬細(xì)胞。體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞經(jīng)顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)豐富多樣，有偽足和突起伸出，胞漿豐富，具有典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)特征。

吞噬功能是檢驗巨噬細(xì)胞活力的重要方法之一，張華等[7]向小鼠腹腔注射雞紅細(xì)胞，進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬試驗，間隔12 h后收集細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞吞噬率為26.0%；韓忠燕等[8]將巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞共孵育16 h后收集細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)23.6%的細(xì)胞吞噬了雞紅細(xì)胞。本研究將分離培養(yǎng)的山羊肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗，37℃共孵育1 h后收集細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞吞噬率為54.5%。本研究結(jié)果相比之前報道的效率稍高，可見進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬試驗時，影響吞噬結(jié)果的不僅有細(xì)胞活性，還有兩種細(xì)胞共孵育的時間、數(shù)量比等。吞噬是一個動態(tài)的過程，若兩者共孵育時間過長，部分巨噬細(xì)胞已經(jīng)崩解，觀察到的吞噬率會偏低；本研究中雞紅細(xì)胞量較多，大部分巨噬細(xì)胞都吞噬了多個雞紅細(xì)胞。

CD14是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞膜表面脂質(zhì)豐富的區(qū)域，而在內(nèi)皮細(xì)胞等表面則未發(fā)現(xiàn)CD14的存在，目前已被廣泛用來鑒定單核巨噬細(xì)胞[12,13]。陳玉惠等[9]將牛外周血單核巨噬細(xì)胞在體外分化培養(yǎng)后，流式檢測其表面CD14的陽性率為62.43%，林煒明等[11]用免疫磁珠法分離外周血單核細(xì)胞，CD14的陽性率從分選前的10%提高到85.8%；本研究中分離的山羊肺泡巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)近一個月后，其表面經(jīng)檢測有93.76%的細(xì)胞表達(dá)CD14，說明培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞仍具有其固有的免疫學(xué)特性，并且純度極高，無其它細(xì)胞污染。

本研究通過PBS灌注法，結(jié)合密度梯度離心，成功的從山羊肺臟中分離了高純度的CD14+肺泡巨噬細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞在體外形態(tài)多樣，有偽足和突起伸出，呈典型的巨噬細(xì)胞特征；分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有很好的吞噬活性及生物學(xué)特性，為巨噬細(xì)胞相關(guān)的疾病機(jī)理的研究提供了材料。

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(1.上海轉(zhuǎn)基因研究中心，上海 201203； 2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009； 3.揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009)

目的 建立一種高純度的肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，為研究巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性，開展細(xì)胞內(nèi)寄生菌存活機(jī)理研究提供材料。方法 在無菌環(huán)境下以PBS多次灌洗山羊肺臟，收集細(xì)胞后，用外周血單核細(xì)胞分離液結(jié)合密度梯度離心法從混合細(xì)胞中分離出羊肺泡巨噬細(xì)胞；培養(yǎng)于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并利用其對雞紅細(xì)胞的吞噬功能檢測細(xì)胞活性；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞表面特征性標(biāo)志CD14。結(jié)果 獲得的貼壁細(xì)胞具典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，有偽足和突起伸出，呈現(xiàn)圓形及不規(guī)則形狀，胞漿豐富，胞體較大；培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞54.5%吞噬了雞紅細(xì)胞，具有較強的吞噬活性；在體外連續(xù)培養(yǎng)近一個月，仍有93.7%的細(xì)胞能特異性表達(dá)CD14抗原，具有巨噬細(xì)胞特異性免疫表型。結(jié)論 本研究獲得的山羊肺泡巨噬細(xì)胞純度高、生物活性好，為開展細(xì)胞內(nèi)寄生菌的疾病機(jī)理研究提供了細(xì)胞模型。

山羊；巨噬細(xì)胞；分離培養(yǎng)；形態(tài)學(xué)觀察；體外吞噬；流式細(xì)胞鑒定

Isolation, culture and identification of goat alveolar macrophages

JI Xiao-fang1,2， YU Hui-qing1*， YUE Liang-liang1,3， XU Xu-jun1， CHEN Jian-quan1， CHENG Guo-xiang1， LIU Zong-ping2
(1.Shanghai Transgenic Research Center，Shanghai 201203, China； 2.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009； 3.College of Biological Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009)

Objective In order to study the biological characteristics of macrophages and provide the materials to study the survival mechanism of intracellular parasites, we conducted this study to establish a high-purity alveolar macrophage isolation and culture method.Methods Goat lungs were lavaged with normal saline in sterile environment several times, and cells were collected and then goat alveolar macrophages were purified by density gradient centrifugation using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) solution. The isolated goat alveolar macrophages were cultured in cell culture medium containing 10% fetal bovine serum and cell morphology was observed under an inverted microscope every day，and the phagocytic activity of the cells was detected by chicken red blood cell phagocytosis test. Flow cytometry was used to detect CD14, a characteristic monocyte-macrophage surface marker.Results The adherent cells were characterized by typical macrophage morphology, pseudopodia and protrusions, showing round and irregular shape, rich cytoplasm, and large cell body. Of the cultured macrophages, 54.5% could phagocytize chicken erythrocytes and showed good phagocytic activity. After one month of in vitro culture, 93.7% of the cells were able to express CD14 antigen, which had a macrophage-specific immunophenotype. Conclusions The alveolar macrophages obtained in this study have high purity and good bioactivity, thus provide a cell model for studying the immune mechanism of intracellular parasites.

Goat; Alveolar macrophage; Isolation and culture; Morphology; In vitro phagocytosis; Flow cytometry

國家轉(zhuǎn)基因重點專項(2014ZX0800801B)；上海市科技興農(nóng)攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字2014第7-1-12號)。

吉小芳(1990-)，女，碩士生，研究方向：轉(zhuǎn)基因動物與生物制藥。E-mail： 15205275290@163.com

俞慧清(1974-)，副研究員，博士，研究方向：轉(zhuǎn)基因動物與生物制藥。E-mail： yhq202@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0075-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.015

2016-12-12