C57BL/6J 小鼠凍融IVF原核胚用于Cas9 顯微注射探討

曾文滔，周建麗，趙書琴，張亞男，梅 云

研究報告

C57BL/6J 小鼠凍融IVF原核胚用于Cas9 顯微注射探討

曾文滔*，周建麗，趙書琴，張亞男，梅 云

體外受精(Invitrofertilization，IVF)與胚胎冷凍技術已廣泛應用于不孕不育醫學、種質資源保存、物種運輸等行業[1-3]，大量文獻證明冷凍胚胎的發育時期、保存時間長短對復蘇存活率、附植及產仔率沒有明顯的影響[4,5]，凍融自然受精原核胚很早就被用于轉基因鼠制作[6-8]，IVF受精胚凍融后用于顯微注射還鮮有報道，對小鼠基因模型構建將有重要的實用意義。

C57BL/6(B6)小鼠一直是基因模型鼠制作的主要品系，超數排卵后自然交配獲得原核胚或早期胚胎進行基因改造[9]。隨著B6小鼠體外受精技術的完善，采用凍精(鮮精)IVF技術批量生產胚胎可節約大量科研經費和時間，大型基因編輯實驗室已經實現無活體雄鼠化模式(或少量)。但使用IVF獲得雙原核胚胎至少需要8 h，對后續實驗的連續性影響很大，本文針對這一關鍵點，對B6小鼠原核胚凍融后的存活率、注射存活率及2細胞發育率做了相關實驗比較，探討IVF結合胚胎冷凍技術應用于Cas9顯微注射的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，5只，10周齡，體重25～28 g；SPF級雌性C57BL/6J小鼠，40只，3～4周齡，體重11～13 g，均購自南京醫科大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2016-0002]。雄鼠單只飼養，雌鼠適應光照周期1周，飼養與實驗均在南京醫科大學實驗動物中心屏障環境[SYXK(蘇)2016-0016]，環境溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，光照周期12 L:12 D,光照時間08:00～20:00。動物實驗方案經過南京醫科大學實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要耗材與儀器

1.2.1 試劑耗材

獲能液(modified Krebs Ringer bicarbonate solution，TYH)[1]；受精液(human tubal fluid,HTF)[1]；培養液M16(Sigma， M7292)；促卵泡液(equine chorionic gonadotr-opin，eCG；Syntex)；促排卵液(human chorionic gonad-otropin，HCG；Syntex)；石蠟油(Sigma，M8410)；35 mm培養皿(Corning，430165)；胚胎測試水(Water；Sigma，W1503)；注射稀釋物(Injection buffer)，溶液配制試劑全部購置于Sigma。

1.2.2 主要儀器

CO2培養箱(Binder);生物安全柜(Esco，class II type A2);體視顯微鏡(Olympus);冷光源(Olympus);顯微操作儀(Olympus);電動氣壓注射泵(Eppendorf);拉針儀(Sutter，P-2000);煅針儀(Narishige，MF-900);液氮罐(CBS);手術器械1套;口吸管(自制)。

1.2.3 注射物

Cas9表達質粒(Addgene No.44758) PCR擴增獲得線性化產物，在體外由試劑盒T7 UltraKit (Ambion，AM1345)完成轉錄。SgRNA 的表達載體PCR擴增獲得線性化產物，sgRNA由試劑盒MEGAshortscript Kit (Ambion,AM1354) 在體外利用T7 RNA 聚合酶完成轉錄。Cas9 mRNA 和sgRNA 分裝，保存于-80℃冰箱[10]。

1.3 實驗方法

1.3.1 原核胚獲得

按董婉維等[1,11]方法進行超數排卵和取卵，HCG注射14 h后進行IVF，按Takeo等[1]方法進行精子采集、獲能和體外受精。

1.3.2 胚胎冷凍

1 mL凍存管加入50 μL EFS40凍存液待用，30～60枚/批移入EFS20預處理并洗滌3遍，2 min后轉入凍存管EFS40中，1 min 后投入液氮儲存，冷凍液參照梁洋等[12]方法。

1.3.3 胚胎復蘇

37℃ 預熱0.25 mol/L 與0.75 mol/L 蔗糖解凍液，凍存管取出后迅速擰開蓋子倒出液氮并靜置10 s，加入1 mL 0.75 mol/L 蔗糖解凍液輕輕吹吸，撿取胚胎后移入0.25 mol/L 蔗糖解凍液平衡3～5 min，待卵裂球恢復擴展后移入M16培養。

1.3.4 胞質注射

將25 ng /μL Cas9 mRNA 和10 ng /μL sgRNA(注射稀釋物稀釋)混合，空白對照為注射稀釋物，置于冰盒上備用。室溫下50枚/批移入M2 操作液，顯微操作儀輔以電動氣壓注射泵胞質注射Cas9樣品，目測針尖前輕微膨脹即可停止，以此反復。

1.3.5 胚胎培養

所有操作后的胚胎需在M16培養液(每滴30 μL)中洗滌3遍，再30枚/滴培養，14 h 后統計2細胞發育率。

1.3.6 形態觀察

復蘇后胚胎出現透明帶脫落、撕裂、胞質溶解、萎縮、碎裂視為死亡，注射后30 min 胚胎胞質出現溶解萎縮視為死亡，受精卵未發育、卵裂球不均勻計入發育率。

1.4 統計學方法

應用IBM SPSS Statistics 19.0統計軟件進行分析，兩樣本率的比較采用χ2獨立性檢驗，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 原核胚與2細胞胚的冷凍與復蘇效果比較

原核胚冷凍回收率為92.5%(111/120)，培養30 min 后存活率92.8%(100/111)。2 細胞冷凍冷凍回收率為90.5%(96/106)，培養30 min 后存活率為95.8%(92/96)。結果表明, 原核胚冷凍的回收率、存活率達到90.5%和95.8%。與2 細胞對照組(92.5%、92.8%)差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 胞質顯微注射對凍融原核胚的影響

在室溫(23℃)下顯微注射Cas9，新鮮胚胎組存活率、發育率分別為93.6%(103/110)和98.0%(101/103)；凍融組分別為82.6%(133/161)和98.4%(62/63)；空白新鮮組分別為97.5%(39/40)和100%(39/39)；空白凍融組分別為92%(46/50)和97.8%(45/46)。新鮮組發育率為100%(44/44)，冷凍組發育率為97.3%(37/38)。凍融原核胚注射存活率與各組差異有顯著性(P< 0.05)，發育率各組差異無顯著性(P> 0.05)(表1)。

3 討論

小鼠IVF技術在小鼠擴繁，種資源保存、品系恢復等生產實驗中廣泛應用，較自然交配具有受精時間統一、受精率高等優點，IVF受精卵正在被越來越多的基因編輯實驗用于顯微注射。但長時間的受精過程對顯微注射及胚胎移植工作影響很大，造成工作效率低下，且原核胚的雌雄原核非常小，無法達到原核注射類的實驗要求，而原核胚復蘇后2 h雌雄原核非常接近，核腔膨大。利用胚胎冷凍技術可以自由切換原核胚的發育起始時間，根據實驗量調整復蘇數量有效的避免實驗資源的浪費。

原核胚復蘇存活率雖然與2 細胞復蘇率無顯著差異，但原核胚個體較大，完全套用2 細胞冷凍程序容易造成脫水不徹底，形成的冰晶會對胚胎造成傷害，復蘇時也無法快速恢復形態[13,14]，移入培養液后的滲透壓差會造成急速膨脹而死亡，原核胚冷凍復蘇過程的相關參數還需要進一步的摸索。此外，每管冷凍數目以及復蘇時槍頭口的形態、吹吸力度等操作因素對冷凍效果也有很大的影響。

近年來，基因編輯技術發展迅速，隨著Cas9技術的誕生，基因編輯技術也變得簡單易行，多數實驗經胞質注射就能完成基因編輯工作[15]，對胚胎的機械損傷也小。在本實驗中，冷凍后的原核胚注射質感要差于新鮮組，分析認為可能是透明帶韌性降低，需增加穿刺力度，對胚胎造成一定擠壓，導致成活率顯著差異，另外，在本實驗中，注射樣品的不同對存活率也有一定的影響，但無顯著性差異(P>0.05)，且注射存活率均在60%以上，存活率正常[3]，注射后發育率無顯著差異。本實驗凍存組注射成活率雖然略低于新鮮組，但整體數據證明冷凍原核胚可以作為IVF胚胎顯微注射的優化步驟，將有助于調整工作時間，促進實現無雄鼠化(配種籠)，減少動物飼養量。

表1 顯微注射后原核胚的存活率與發育率對比

注：與新鮮空白注射組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the injected blank fresh embryo group，*P< 0.05.

[1] Takeo T，Nakagata N.Mouse sperm cryopreservation and effective embryo production using cryopreserved C57BL/6 mouse sperm[J].J Mamm Ova Res，2010，27(2010):70-78.

[2] 路佩瑤，張春香，岳文斌.超數排卵在哺乳動物中的應用[J].山西農業科學，2009，37(5)：84-87.

[3] 孫青原，陳大元.小鼠胚胎操作實驗手冊[M].北京：化學工業出版社，2006.

[4] Riggs R，Mayer J，Dowling-Lacey D，et al.Does storage time influence postthaw survival and pregnancy outcome? An analysis of 11,768 cryopreserved human embryos[J].Fertil Steril，2010，93(1):109-115.

[5] Wirleitner B，Vanderzwalmen P，Bach M,et al.The time aspect in storing vitrified blastocysts: its impact on survival rate, implantation potential and babies born[J].Hum Reprod，2013，28(11):2950-2957.

[6] Takahashi R，Hirabayashi M，Ueda M.Production of transgenic rats using cryopreserved pronuclear-stage zygotes[J].Transg Res，1999，8(5):397-400.

[7] Leibo SP, DeMayo FJ, O’malley B.Production of transgenic mice from cryopreserved fertilized ova[J]. Mol Reprod Dev，1991，30(4):313-319.

[8] Bagis H，Odaman H，Sagirkaya H，et al.Production of transgenic mice from vitrified pronuclear-stage embryos[J].Mol Reprod Dev，2002，61(2):173-179.

[9] 曾文滔，張愛華，呂萌，等.調整精卵交匯時間提高C57 BL/6J小鼠超數排卵的受精率[J].中國比較醫學雜志，2013，23(12): 27-30.

[10] 馬元武，馬婧，路迎冬，等.利用 CRISPR/Cas9敲除大鼠胰島素受體底物1(Ir s1)基因[J].中國比較醫學雜志，2014，24(3):55-60.

[11] 董婉維，周生來.FVB 小鼠超排卵及胚胎冷凍技術的研究[J].中國比較醫學雜志，2006，16(11)：652-654.

[12] 梁洋，杜文敬，王春生，等.小鼠早期胚胎的EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷凍保存[J].江西農業大學學報，2010，32(6):1248-1252.[13] 徐勇，張嘉保.哺乳動物胚胎超低溫冷凍保存的研究進展[J].黑龍江動物繁殖，2001，9(1):15-17.

[14] 左琴，岳秉飛，劉雙環，等.近交系小鼠胚胎玻璃化冷凍技術研究[J].中國比較醫學雜志，2001，11(2):82-84.

[15] Mali P，Yang L，Esvelt KM，et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science，2013，339(6121):823-826.

專家問答

問：對于活體成像的定量方式，現有的單位是否可以簡化？比如單位面積對應的信號強度？如何計算腫瘤特異部位和正常對照部位的熒光強度比值？我們曾經嘗試選出一個腫瘤區域和一個背景區域，用這兩個數值的比值去代替，不知道是否合理？

答：我們可以圈選兩個ROI值(region of interest)，如果這兩個ROI值信號采集的時間是一樣的，圈選范圍的面積、大小和形狀也是一致的，那就變得簡單多了，就只需要看光子數量，也就是說可以根據光子數量代表的信號強度來直接進行這樣的量化對比。

(感謝第四軍醫大學 師長宏 教授和冷泉港生物科技股份有限公司分子影像部門副總經理 王志宇 先生的解答)

(南京醫科大學醫藥實驗動物中心，南京 211166)

目的 探討小鼠體外受精(IVF)凍融后用于Cas9注射的可行性。方法 新鮮C57BL/6J小鼠卵子IVF后采用凍存管法(EFS20/40)冷凍原核胚(單細胞胚)和2 細胞胚胎，次日復蘇后培養。比較凍融原核胚和2 細胞胚胎的回收率及成活率。選取部分凍融原核胚與新鮮原核胚同時進行Cas9和稀釋液胞質注射并培養至2細胞，分別比較注射后的存活率及2細胞發育率。結果 凍融后的B6小鼠原核胚的回收率為92.5%、成活率為92.8%，2細胞胚的回收率為90.5%、成活率95.8%，兩組數據差異無顯著性(P> 0.05)。新鮮原核胚Cas9注射后的存活率為92.7%，空白組注射組為97.5%，凍融原核胚Cas9注射后的存活率為82.6%，空白組為92%，凍融組Cas9注射與各組差異有顯著性(P< 0.05)，其它各組差異無顯著性(P> 0.05)。注射后的2 細胞胚發育率差異無顯著性(P> 0.05)。結論 凍融原核胚可用于Cas9顯微注射。

體外受精；受精卵；胚胎冷凍；Cas9；顯微注射

Frozen-thawed pronuclear embryos byinvitrofertilization of C57BL/6J mice can be used for Cas9 microinjection

ZENG Wen-tao*，ZHOU Jian-li , ZHAO Shu-qin, ZHANG Ya-nan, MEI Yun
(Animal Core Facility of Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China)

Objective To verify the feasibility of Cas9 microinjection in frozen-thawed pronuclear embryos, based on the model of pronuclear embryos of C57BL/6J mice by in vitro fertilization. Methods After fertilized mouse pronuclear embryos cultured in vitro, one-cell and 2-cell embryos were frozen using EFS20/40 cryopreservation tube. The next day recovered and then cultured. The recovery rate and survival rate of the one-cell and 2-cell embryos were compared. The frozen-thawed and fresh pronuclear embryos were injected with Cas9 mixture and injection buffer into the cytoplasm, and then cultivated to 2-cell embryos,and the survival rate and development rate of the 2-cell embryos were compared. Results The recovery rate of frozen-thawed one-cell embryos was 92.5%, the survival rate was 92.8%, the recovery rate of 2-cell embryos was 90.5% and the survival rate was 95.8%, showing no significant difference. Furthermore, the survival rate of fresh one-cell embryos after Cas9 injection was 92.7%, the survival rate of one-cell embryos of the blank group was 97.5%. While the survival rate of Cas9 injected frozen-thawed one-cell embryos was 82.6%, and that of the blank group was 92%,showing a significant difference between the frozen-thawed injected group and other groups(P< 0.05).The development rate of 2-cell embryos after Cas9 injection was not significantly different. Conclusions Frozen-thawed pronuclear embryos can be used for Cas9 microinjection.

IVF; Fertilized eggs; Frozen embryos; Cas9; Microinjection

周建麗(1985-)，女，實驗師，研究方向：實驗動物與基因編輯。E-mail： zhoujianli@njmu.edu.cn

曾文滔(1987-)，男，助理實驗師，研究方向：實驗動物與生殖生理。E-mail： wentaozeng@njmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0066-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.013

2016-12-05