逆針灸對慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH的影響*

華金雙，傅 文，邵伯雍

(1.河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046)

·實驗研究·

逆針灸對慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH的影響*

華金雙1，傅 文2，邵伯雍2

(1.河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046)

目的：探討逆針灸對慢性疲勞大鼠促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)的影響。方法：將40只SD大鼠隨機分為4組，即正常對照組、模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組,每組10只。模型對照組先平行飼養，然后采用多因素刺激相結合的辦法制備慢性疲勞大鼠模型，共44 d。逆針灸1組、逆針灸2組在制備模型前依次先給予大鼠電針刺激10 d、20 d，然后再制備慢性疲勞大鼠模型。正常對照組不予任何處理，平行飼養。分別于實驗第1天和最后1天進行開野實驗檢測；采用 ELISA 法檢測各組大鼠血清 ACTH、CORT 、CRH含量。結果：①實驗第44天，與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯下降，差別有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組大鼠對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯增加，差別有統計學意義(P<0.05)；逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動、垂直運動得分對比，差別無統計學意義(P>0.05)。②與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加，差別有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯降低，差別有統計學意義(P<0.01)；逆針灸1組血清ACTH、CORT含量較逆針灸2組明顯降低，差別有統計學意義(P<0.05)；逆針灸2組血清CRH含量較逆針灸1組明顯降低，差別有統計學意義(P<0.01)。結論：逆針灸能通過調控下丘腦-垂體-腎上腺軸降低慢性疲勞大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量，減輕或抵抗隨后長期的應激刺激對機體的損害，從而發揮防治作用。

逆針灸/作用；慢性疲勞綜合征/針灸療法；開野實驗；ACTH；CORT；CRH；動物；大鼠

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一種以長期或慢性反復發作的極度疲勞為突出表現，同時伴有低熱、咽喉痛、淋巴結腫痛、肌肉酸痛、關節疼痛、神經精神癥狀、睡眠障礙等其他非特異性表現的綜合征。目前CFS的發病機制尚無統一認識，多數學者認為CFS的發生與應激、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能異常關系密切。研究[1-3]顯示：引發慢性疲勞綜合征的強有力因素是緊張的生活事件以及隨之而來的HPA軸功能障礙。根據美國疾病控制中心的診斷標準，該病從開始出現癥狀到明確診斷至少有6個月的潛伏時間。此時期，疾病尚處于萌芽階段，若能積極采取預防措施，則有可能防止病情的進一步發展，促使疾病早期治愈。李曉泓[4]認為：逆針灸可以啟動機體內源性保護機制，對機體進行調整，因此預先在“未病”機體上給予針灸刺激，能夠提高機體的抵抗力與應變能力，減輕隨后疾病的損害，是一種激發機體產生良性應激的有效手段。研究[5]發現：逆針灸可使腦內遞質、受體、轉錄調控類基因、熱休克反應等眾多基因發生變化,從而對隨后的疾病起到未病先防、防患于未然的作用。基于此，本實驗通過觀察逆針灸對慢性疲勞大鼠HPA軸的影響，探討逆針灸對慢性疲勞大鼠可能的保護作用，以期為慢性疲勞綜合征的超早期防治提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

雄性SD大鼠，體質量(180±20)g，清潔級，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。所有動物均飼養于溫度(18～25 ℃)和濕度(55%±2%)相對恒定的動物飼養室，自由進食和飲水。

1.2 試劑與儀器

促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)、 促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)試劑盒，均為江蘇卡爾文生物科技有限公司產品，批號依次為20160319A，20160310A，20160319A。華佗牌一次性針灸針，規格為直徑0.30 mm、長度25 mm，蘇州醫療用品有限公司產品。佳健CMNS6-Ⅰ型電子針灸治療儀，無錫佳健醫療器械股份有限公司產品。

1.3 動物分組

適應性飼養1周后，將40只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、逆針灸1組和逆針灸2組，每組10只。

1.4 模型的建立

模型對照組和預處理后的逆針灸組采用多因素刺激方法制備慢性疲勞大鼠模型。①冷水游泳：大鼠游泳桶寬40 cm、高50 cm，大鼠游泳時水深40 cm，水溫21 ℃左右，每次游泳30 min。②束縛法：束縛大鼠四肢，每次3 h。③晝夜顛倒1次。第1個2 4 h，無措施。第2個24 h早8:30用晝夜顛倒鼠籠罩罩住鼠籠，模擬夜晚；晚8:30給予日光燈持續照明，模擬白晝。每次隨機安排1種，使動物不能預料刺激的發生，以避免產生適應性。共21 d。

1.5 針刺方法

逆針灸1組：大鼠先平行飼養10 d，再給予電針刺激10 d，然后制備慢性疲勞大鼠模型。穴位選取百會、足三里、三陰交、太沖。頭部穴位平刺進針，四肢穴位直刺進針，用30號1寸毫針，深度為0.5～1 cm，電針頻率為2 Hz，電流強度為0.6 mA，以大鼠頭部微顫為宜。每次20 min。5 d為1個療程，中間休息1 d，共4個療程。逆針灸2組：先給予大鼠電針刺激20 d，再制備慢性疲勞大鼠模型。針灸操作同逆針灸1組。模型對照組和正常對照組同逆針灸組平行飼養，不做任何處理。

1.6 檢測指標

1.6.1 開野實驗(open-field)

分別于實驗第1天和最后1天進行。方法：將大鼠置于敞箱底面的中心方格內，記錄大鼠水平運動得分和垂直運動得分。水平運動得分標準為：動物穿越底面塊數(四爪均進入的方格方可記數)，每穿越1塊計1分。垂直運動得分標準為：大鼠后腿直立次數(兩前爪騰空或攀附箱壁)，每次計1分。每次測定時間6 min。

1.6.2 血清ACTH、CORT、CRH含量

實驗結束時，逆針灸兩個組各死亡1只大鼠。稱量剩余大鼠體質量并記錄，根據體質量，以100 g/L水合氯醛3μL/g體質量腹腔麻醉大鼠；將麻醉后的大鼠平鋪于操作臺上，切開腹部，暴露下腔腹主動脈；用注射器抽取5 mL血液，迅速注入試管中，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min；取上清液，注入一次性EP管中，做好標記，放入- 70 ℃冰箱中保存待檢。采用酶聯免疫法測定血清ACTH、CORT、CRH含量，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠開野實驗結果對比

各組大鼠實驗第1天水平運動得分對比，P>0.05，差別無統計學意義，說明各組基線情況一致，具有可比性。實驗第44天：除正常對照組外，其余各組大鼠水平運動得分均較第1天明顯減少，差別有統計學意義(P<0.05)。與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動得分明顯下降，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組大鼠對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動得分明顯增加，差別有統計學意義(P<0.05)。逆針灸1組、逆針灸2組大鼠水平運動得分對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠水平運動得分對比 分，±s

注：與同組實驗前對比，*P<0.05;與同時間點正常對照組對比，##P<0.01;與同時間點模型對照組對比，ΔP<0.05;與同時間點逆針灸1組對比，＊P>0.05。

各組大鼠實驗第1天垂直運動得分對比，P>0.05，差別無統計學意義，說明各組基線情況一致，具有可比性。實驗第44天：除正常對照組外，其余各組大鼠垂直運動得分均較第1天明顯減少，差別有統計學意義(P<0.05)。與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠造模后垂直運動得分明顯減少，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠垂直運動得分明顯增多，差別有統計學意義(P<0.05)。逆針灸1組和2組垂直運動得分對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠垂直運動得分對比 分，±s

注：與同組實驗前對比，*P<0.05;與同時間點正常對照組對比，##P<0.05;與同時間點模型對照組對比，ΔP<0.05;與同時間點逆針灸1組對比，＊P>0.05。

2.2 各組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量對比

與正常對照組對比，模型對照組、逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，逆針灸1組、逆針灸2組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯降低，差別有統計學意義(P<0.01)。逆針灸1組血清ACTH、CORT含量較逆針灸2組明顯降低，差別有統計學意義(P<0.05)。逆針灸2組血清CRH含量明顯降低，與逆針灸1組對比，差別有統計學意義(P<0.01)。見表3。

組 別動物數ACTH/(ng·L-1)CORT/(μg·L-1)CRH/(ng·L-1)正常對照組1019．343±2．498159．635±21．18921．497±3．197模型對照組1052．128±5．030???304．190±26．685???57．436±4．421???逆針灸1組934．177±2．649???###200．997±14．397???###42．074±2．925???###逆針灸2組937．932±2．762???###ΔΔ219．173±15．065???###ΔΔ35．992±4．031???###ΔΔΔ

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，###P<0.01；與逆針灸1組對比，ΔΔP<0.05; ΔΔΔP<0.01。

3 討 論

現代研究已證實：慢性疲勞綜合征患者的慢性疲勞、焦慮等臨床癥狀與HPA軸功能異常關系十分密切。HPA軸的主要作用是維持機體內穩態和應激反應的應答。當機體長期處于慢性應激刺激時，HPA軸會被激活，處于異常狀態，使CORT和其他激素釋放的增加,從而導致機體內分泌、免疫等系統功能紊亂，產生多種癥狀[6-7]。應激信號通過相應的神經遞質將信息匯聚于下丘腦室旁核,這些神經元合成CRH，并刺激垂體前葉合成、分泌ACTH，最終ACTH釋放入周圍血循環，刺激腎上腺皮質細胞合成、釋放以CORT為主體的糖皮質激素。CRF是機體調節應激反應的關鍵因子，CORT是HPA軸的最終效應器,它可以負反饋地調節CRF和ACTH的分泌,抑制HPA軸興奮性,形成HPA軸的環行調節通路。可以看出：下丘腦、垂體和腎上腺組成一個相互協調的反饋調節系統，從而維持血中CORT濃度的相對穩定和應激狀態下的適應性反應。大量臨床研究[8-11]表明了針灸能明顯改善慢性疲勞綜合征患者的臨床癥狀，動物實驗[12-13]也顯示了針灸對慢性疲勞大鼠神經-內分泌系統，尤其是對HPA軸的良性調節作用,這些研究為逆針灸防治慢性疲勞大鼠奠定了堅實的基礎。

逆針灸一詞，首見于明代高武的《針灸聚英》[14]，原文為“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也” 。意即：在機體健康無病、疾病即將發生之前或疾病輕淺之時預先采用針灸方法激發經絡之氣，提高正氣，平衡陰陽，可以防止疾病發生，減輕疾病損害的程度。本研究所選足厥陰肝經之原穴太沖，具疏肝解郁、調暢氣機之效；足太陰脾經之三陰交，配伍足陽明胃經之足三里穴，可健脾和胃，調和氣血，共奏調暢氣機、補益氣血、強筋壯骨之功；百會為督脈穴，督脈通于腦，具有健腦寧神之功。四穴合用，調暢氣機，調和氣血，扶正固本，能有效地調動機體的自我防御能力，從而對機體隨后的紊亂狀態做出良性調整，起到防病治病的作用。

本研究中的開野實驗結果顯示：除正常對照組外，各組大鼠水平運動得分和垂直運動得分均明顯降低。此說明經過多種慢性應激因素所致的慢性疲勞模型大鼠自主探索行為明顯降低，并伴有心理焦慮；而提前給予逆針灸干預則能明顯改善大鼠的自主探索行為，增加水平運動和垂直運動得分。實驗結果提示：逆針灸具有調節作用。此外，本研究中模型對照組大鼠血清ACTH、CORT、CRH含量明顯增加(P<0.01)，提示長期應激刺激可使HPA軸持續亢進，血中ACTH、CORT、CRH含量升高，超過了大鼠自身調節的范圍，說明本實驗造模方法是成功的。逆針灸1組、2組與模型對照組對比，血清ACTH、CORT、CRH含量顯著降低(P<0.01)，提示通過預先電針干預，可能啟動了機體內部的保護機制，當再次受到長期應激刺激時，通過機體自身的調整，能有效地維持HPA軸的環行調節通路，使機體對再次的不良刺激產生相對穩定的適應性反應，這可能是逆針灸防治慢性疲勞綜合征的機制之一。慢性疲勞綜合征的病因病機十分復雜，需要體內諸多細胞因子、基因等共同參與完成。逆針灸雖然是一種有效的預處理手段，但其對慢性疲勞大鼠的預防作用應是多系統、多靶點的綜合干預，因此對逆針灸的作用環節尚需進一步深入研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)08-0067-04

R245.3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.08.29

華金雙(1974-)，女(漢族)，黑龍江大慶人，副教授，博士，研究方向：針灸防治神經系統疾病的基礎研究。

河南省高等學校重點科研項目(15A360023)

2017-03-06；

2017-07-14