乙醛脫氫酶基因敲除對明串珠菌產甘露醇的影響

王立東 成文玉 金紅星（河北工業大學化工學院，天津 300130）

乙醛脫氫酶基因敲除對明串珠菌產甘露醇的影響

王立東 成文玉 金紅星（河北工業大學化工學院，天津 300130）

為了提高甘露醇產量，研究了乙醛脫氫酶基因敲除對明串珠菌碳代謝的影響。利用四環素抗性基因構建了攜帶抗性標記的同源重組載體；將攜帶抗性標記的同源重組載體酶切產生無抗性標記的同源重組載體；經過兩次同源重組獲得了乙醛脫氫酶基因敲除菌株即突變菌株。三基因敲除的突變菌株LeuΔdtsΔldhΔaldh甘露醇產量（9.35 g/L）比原始菌株（7.87 g/ L）提高18.8%，乙醇含量產量下降了62%。

明串珠菌；基因敲除；乙醛脫氫酶；甘露醇；乙醇

甘露醇是一種己六醇，在醫藥、食品、電子和化工等眾多領域均得到廣泛的應用[1]。目前，工業生產甘露醇主要有兩種工藝：海藻提取法在生產過程產生大量廢水、污染嚴重、收率低；催化加氫法的產率較低、且有山梨醇伴生。實驗室生產甘露醇的方法有兩種：酶轉化法在體系中加入昂貴的輔酶，不經濟；微生物發酵法不產生其它多元醇等副產物且條件溫和。產甘露醇的微生物中，明串珠菌由于基因組較小、轉化率較高，因此有著明顯的優勢。明串珠菌是進行異型乳酸發酵的G+，是FDA認可的GRAS菌，因沒有醛縮酶而不進行糖酵解，底物通過PPK途徑而脫氫并產生能量[2]。

本文探討了乙醛脫氫酶（aldh）基因敲除對明串珠菌產甘露醇的影響，從而揭示了碳代謝中通量變化規律，為明串珠菌的遺傳育種奠定了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株與質粒：腸膜明串珠菌CGMCC1.10327，大腸桿菌DH5α，質粒pTA2-Tet、大腸桿菌-明串珠菌穿梭載體pCW4均由本實驗室保存。

培養：大腸桿菌用LB培養基培養；明串珠菌用MRS培養基培養。

內切酶為TAKARA的，Taq DNA聚合酶為天津謙泰的，化學試劑為分析純。

所用到的引物列于表1。

表1 引物

1.2 方法

1.2.1 乙醛脫氫酶基因部分序列的克隆

參照Vingataramin等的方法[3]提取明串珠菌染色體DNA并做模板，PCR擴增了乙醛脫氫酶基因aldh，構建了載體pTA2-aldh。

1.2.2 aldh的同源重組載體與互補型載體的構建

pTA2-aldh做模板，以P1-P2、P3-P4為引物，分別擴增aldh的前、后同源臂aldh-L和aldh-R，并分別插入到pTA2-Tet質粒的KpnI和XhoI、PstI和XbaI酶切位點上，構建了攜帶抗生素抗性標記的同源重組載體pTA2-aldhL-Tet-aldh。用EcoRI酶切pTA2-aldhL-Tet-aldhR而去除四環素表達盒，獲得了無抗生素抗性標記的同源重組載體pTA2-aldhL-aldhR。

以明串珠菌染色體DNA為模板，利用P5-P6引物PCR擴增了aldh基因表達盒，插入到pCW4的XhoI酶切位點上，構建了互補型表達載體pCW4-aldh。

圖1 同源重組載體與互補型載體的驗證Fig.1 Verification of homologous recombinant vectors and complementary vector

圖3 甘露醇產量的比較Fig 3 comparison of mannitol production

圖4 乙醇產量的比較Fig 4 comparison of ethanol production

圖2 突變菌株的PCR驗證Fig.2 PCR validation of mutant strains1、Marker 2、原始菌株3、Leu△aldh-Tet 4、Leu△aldh

1.2.3 明串珠菌的電擊轉

參照張舟等的電擊轉化方法將質粒導入到明串珠菌受體細胞中。導入pTA2-aldhL-Tet-aldhR而獲得攜帶抗生素抗性標記的同源重組菌LeuΔaldh-Tet，再導入pTA2-aldhL-aldhR而獲得無抗生素抗性標記的同源重組菌LeuΔaldh，LeuΔaldh中導入pCW4-aldh而獲得互補型菌株LeuΔaldh/aldh。

1.2.4 發酵

將明串珠菌同源重組菌株與原始菌株分別接種于裝有5 mL MRS中，120 r/min振搖培養16 h后，以10%的接種量接種于裝有20 mL MRS中，培養20 h后檢測甘露醇和乙醇[4-5]。

2 結果

2.1 同源重組載體pTA2-aldhL-Tet-aldhR和pTA2-aldhL-aldhR的構建

先將前同源臂插入到pTA2-Tet而獲得重組載體pTA2-aldhL-Tet，再插入后同源臂而獲得同源重組載體pTA2-aldhLTet-aldhR，重組載體的酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳見圖1A和1B，從圖可以看出符合預期的結果。無抗生素抗性標記的同源重組載體pTA2-aldhL-aldhR的酶切驗證電泳見圖1C，互補型表達載體pCW4-aldh的酶切驗證結果見圖1D，從圖可以看出符合預期的結果。

2.2 突變菌株的PCR驗證

為了驗證突變菌株的aldh序列是否發生改變，分別提取基因失活菌株（發生一次同源重組的菌株即攜帶抗生素抗性標記的）、基因敲除菌株（發生兩次同源重組的菌株即抗生素抗性標記的）和原始菌株的染色體DNA并做模板，利用P7-P8引物進行PCR，產物的電泳結果見圖2，從圖2可見符合預期結果。

2.2 甘露醇和乙醇的產量

比較了原始菌株、LeuΔdts[6]、LeuΔdtsΔldh、LeuΔdtsΔldhΔaldh和LeuΔaldh的甘露醇產量，見圖3，從圖3可知，單敲除aldh的（8.26 g/L）比原始菌株產量（7.87 g/L）提高5%，疊加敲除三個基因的（9.35 g/L）比原始菌株產量提高18.8%。比較原始菌株、LeuΔdtsΔldhΔaldh和LeuΔaldh的乙醇產量，從圖4可知，單敲除aldh的和疊加敲除三個基因的比原始菌株產量減少60%左右。

從圖3和圖4可以看出，互補型菌株LeuΔaldh/aldh的甘露醇和乙醇產量恢復到原始菌株的水平，由此可見，突變菌株LeuΔaldh的甘露醇產量提升和乙醇產量下降是aldh基因敲除引起的。

3 討論

在微生物細胞內，NADH為還原力將果糖轉化為甘露醇。史建波[7]為了降低發酵成本，以蔗糖替換了果糖；張舟[6]為提高蔗糖的轉化率敲除了葡聚糖蔗糖酶基因；田云飛為提高甘露醇產量敲除了D-乳酸脫氫酶基因；本研究為提高甘露醇產量敲除了乙醛脫氫酶基因。由此可見，敲除消耗底物反應的酶編碼基因或消耗NADH反應的酶編碼基因都可以增加甘露醇合成。

[1]金紅星,成文玉.明串珠菌發酵產甘露醇的研究進展[J].中國釀造,2012,(10):4-6.

[2]成文玉,金紅星,金正煥.明串珠菌的碳代謝調控研究進展[J].中國釀造,2012,(06):6-8.