以二抗為基底豬瘟抗體ELISA 檢測方法建立

劉麗婭 汪萍 苗書魁[新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 （新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心） 830000]

以二抗為基底豬瘟抗體ELISA 檢測方法建立

劉麗婭 汪萍 苗書魁*[新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 （新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心） 830000]

為驗(yàn)證以鼠抗豬IgG為基底，用辣根過氧化物酶標(biāo)記豬瘟E2蛋白，建立的豬瘟抗體ELISA檢測方法的可行性，對(duì)影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的主要條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，鼠抗豬IgG最佳包被濃度為1μg/ml，酶標(biāo)豬瘟E2蛋白最佳稀釋度為1：500，最佳封閉液為1%BSA。建立的方法對(duì)豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清均無交叉反應(yīng)。通過對(duì)50份試驗(yàn)樣本的檢測，對(duì)比該方法與商品化IDEXX的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒的符合性，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測豬瘟抗體的相對(duì)敏感性為76.9% （30/39），相對(duì)特異性為90% （45/50）。

二抗；豬瘟；抗體；ELISA方法

豬瘟是流行較早的疫病，在疫病監(jiān)測與防控中豬瘟病毒抗體ELISA試劑盒發(fā)揮著重要作用。目前針對(duì)豬瘟病毒抗體的ELISA檢測方法有：IDEXX豬瘟抗體試劑盒和荷蘭賽迪公司的豬瘟抗體試劑盒檢測效果相對(duì)較好[1-5]。國內(nèi)對(duì)豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒的研究一直是熱點(diǎn)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等研制的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒2016年獲批新獸藥。本實(shí)驗(yàn)采用包被二抗的方法，包被的二抗與豬血清中的IgG抗體結(jié)合，第三步將經(jīng)過酶標(biāo)記的豬瘟E2蛋白與豬瘟抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[1]，從而對(duì)豬瘟抗體進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒購自東仁化學(xué)科技 （上海）有限公司，豬瘟E2蛋白由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所病毒室自制，包被緩沖液、PBST溶液、酶標(biāo)終止液均為自配。96孔高親和力可拆分酶標(biāo)板，購自從Costar公司；小鼠抗豬二抗購自上海士峰生物；酶標(biāo)底物TMB購自Promega公司，BSA購自上海百賽生物科技有限公司。

1.2 辣根過氧化物酶標(biāo)記豬瘟E2蛋白

按試劑盒說明書對(duì)豬瘟E2蛋白進(jìn)行酶標(biāo)記。

1.3 抗體包被濃度與血清稀釋度的選擇

將鼠抗豬二抗以1.5μg，1μg，0.5μg包被酶標(biāo)板，血清稀釋為1：2、1：5、1：10，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD450值，根據(jù)OD450值選擇最佳抗體包被濃度及血清最佳稀釋度。

1.4 最佳封閉液的選擇

封閉液分別為1%BSA、2%馬血清、5%脫脂奶粉，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD450值，根據(jù)OD450值選擇最佳封閉液。

1.5 以二抗為基底的豬瘟抗體ELISA診斷方法建立

將100μl的1：2稀釋待檢血清及陽性、陰性對(duì)照血清分別加入已經(jīng)包被過二抗的96孔酶標(biāo)板中，用封板膜封板后置37℃溫育1h，棄去液體，每孔加300μl的PBST洗滌3～5次，加入100μl的1：500倍稀釋HRP-豬瘟E2蛋白，用封板膜封板后置37℃溫育1h，棄去液體，每孔加300μl的PBST洗滌3～5次，每孔加入50μl的TMB溶液，15min后每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

1.6 結(jié)果判定

要使試驗(yàn)有效，需符合下列條件：陽性對(duì)照的平均值減去陰性對(duì)照的平均值必須大于或等于0.150；此外，陰性對(duì)照的平均值必須小于或等于0.150。結(jié)果計(jì)算方法：陽性對(duì)照平均值陰性對(duì)照平均值樣本的計(jì)算結(jié)果判定：CSFV抗體的有無是通過計(jì)算每個(gè)樣品的S/P值判定。如果S/P值低于0.40，樣品應(yīng)判為CSFV抗體陰性。如果S/P值大于或等于0.40，樣品應(yīng)判定為CSFV抗體陽性。

1.7 對(duì)其他豬病血清的交叉反應(yīng)

將豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清，檢測有無血清交叉反應(yīng)。

1.8 與商品化試劑盒對(duì)比的符合性試驗(yàn)

通過檢測樣本的陽性數(shù)量與陰性數(shù)量的關(guān)系判定與IDEXX試劑盒的相對(duì)特異性及相對(duì)敏感性。

2 結(jié)果

2.1 抗體包被濃度與血清稀釋度的選擇

通過正交試驗(yàn)進(jìn)行9次不同組合的篩選，最終確定二抗最佳包被濃度為1μg/ml，待檢血清最佳稀釋度為1：2，見表1。

2.2 最佳封閉液

選擇1%BSA、2%馬血清、5%脫脂奶粉為封閉液，通過對(duì)不同稀釋度的陽性血清、陰性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)OD450值確定1%BSA為最佳封閉液，見表2。

2.3 對(duì)其他豬病血清的交叉反應(yīng)

檢測該方法對(duì)豬藍(lán)耳病陽性血清、豬圓環(huán)病陽性血清、豬亞洲1型口蹄疫陽性血清、豬O型口蹄疫陽性血清有無交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果均為陰性，見表3。

2.4 與商品化試劑盒對(duì)比的符合性試驗(yàn)

通過對(duì)50份試驗(yàn)樣本的檢測，對(duì)比該方法與商品化IDEXX的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒的符合性，該方法檢測豬瘟抗體的相對(duì)敏感性為76.9% （30/39），相對(duì)特異性為90%（45/50）， 見表 4。

3 討論

本試驗(yàn)使用HRP標(biāo)記試劑盒對(duì)豬瘟E2蛋白進(jìn)行標(biāo)記，通過對(duì)二抗包被、血清稀釋度、酶標(biāo)抗原稀釋度等主要參數(shù)的篩選，建立以二抗為基底的豬瘟抗體ELISA診斷方法。該方法的優(yōu)勢在于可以通過增加酶標(biāo)抗原，完成兩種針對(duì)性抗體的檢測。使用者可以根據(jù)需求對(duì)樣品進(jìn)行隨機(jī)檢測，可分別檢測兩種標(biāo)記抗原的抗體，也可只選擇其中任意一種標(biāo)記抗原進(jìn)行對(duì)應(yīng)抗體的檢測，降低使用成本。

本方法對(duì)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性及陰性對(duì)照血清的檢測效果良好，通過臨床試驗(yàn)樣品檢測證實(shí)該方法的相對(duì)敏感性為76.9% （30/39）， 相對(duì)特異性為90% （45/50）。 該方法的敏感性不高，分析原因與自然條件下豬感染的疾病較復(fù)雜，接觸的病原更具多樣性，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，產(chǎn)生的針對(duì)性抗體會(huì)與豬瘟抗體競爭結(jié)合于二抗，從而使該方法對(duì)臨床樣本的敏感性降低。

表1 不同濃度二抗、不同血清稀釋度CSFV抗體檢測結(jié)果

表2 不同封閉液CSFV抗體的檢測結(jié)果

表3 幾種陽性血清的交叉性試驗(yàn)

表4 兩種檢測方法的符合率試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

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[2]魏海燕,曾靜,張偉,等.ELISA檢測試劑盒在出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用與質(zhì)控[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2015,25(4)：55-57.

[3]李紅梅,陳佳,徐斐,等.ELISA測定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2010(2)：126-130.

[4]張偉,傅溥博,高宏偉,等.ELISA操作注意事項(xiàng)及不確定度分量分析[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2015,25(4)：52-55.

[5]常婭莉,席仲興,吳智遠(yuǎn),等.鼠疫菌F1抗體雙抗原夾心ELISA診斷試劑盒的研制[J].中國生物制品學(xué)雜志,2013,26(12)：1801-1804.

[6]Mijung J,Byungki C,Young SC.Development of a Quantitative Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for De tecting the MPT64 Antigen of Mycobacterium tuberculosis[J].Yonsei Med J,2014,55(3)：746-752.

劉麗婭 （1984-），女，安徽省阜陽市人，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病研究。*

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