羊肚菌液體培養基的篩選

程遠

(五常市寶龍店種子林場，黑龍江 哈爾濱 150200)

羊肚菌液體培養基的篩選

程遠

(五常市寶龍店種子林場，黑龍江 哈爾濱 150200)

以5種不同的液體培養基配方(Y1：麥麩、黃豆粉；Y2：馬鈴薯、黃豆粉；Y3：馬鈴薯、酵母膏；Y4：麥麩、酵母膏；Y5：米糠、黃豆粉)對羊肚菌進行液體培養，結果表明：Y4培養基中菌球大小均勻、個數多為95個·(100 mL)-1，菌絲生物量最大，為10.24 g·L-1，菌絲粗多糖得率最高，為11.45%。在5種培養基中，麥麩、酵母膏培養基為最佳培養基。

羊肚菌；液體培養基；篩選

羊肚菌(morchellaesculentaL.Pars)俗稱羊肚菜，陽雀菌[1]。是一種名貴的食藥用真菌[2]。羊肚菌屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizaies)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)[3-5]。主要分布于我國的云南、甘肅、四川、青海、黑龍江、寧夏、新疆等地[6]。羊肚菌無毒，性平，味甘寒，中醫認為其具有益脾胃、提神、補腦的功能，可用于治療脾虛滑瀉，消化不良，氣虛多痰等癥[7]。近年來，研究者們發現羊肚菌具有抗氧化[8]、抗癌[9]、抗疲勞[10]、保肝[11]、保腎[12]、降低血脂[13]等功效。而羊肚菌的多糖是羊肚菌的重要活性物質之一，具有抗氧化、抗疲勞、抑腫瘤、抗菌、增強免疫力等多種藥理活性。近年來，隨著羊肚菌研究的深入，羊肚菌在醫藥、保健品、食品等領域具有廣闊的開發前景。液體培養羊肚菌，具有速度快、周期短、成本低、無污染等優點。本文用5種不同的液體培養液培養羊肚菌，通過比較羊肚菌的菌絲體生物量和菌絲中粗多糖的含量，選擇出最佳的培養基配方。

1 試驗材料

1.1 平板菌種培養基配方

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，自來水1 000 mL，pH6。

1.2 液體培養基配方

Y1：麥麩4%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y2：馬鈴薯20%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y3：馬鈴薯20%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y4：麥麩4%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y5：米糠4%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL。

2 試驗方法

2.1 平板菌種的制備

按照1.1的培養基配方，加入18 g瓊脂，制成羊肚菌培養基，倒入三角瓶內于121 ℃下的高壓滅菌鍋中滅菌20 min。滅好菌后，在無菌操作臺中趁熱將培養基導入平板中，水平放置到室溫。待平板培養基冷卻后，用滅菌的接菌勾取一小塊試管種置于平板培養基的中央。接好菌后用封口膜封好，將平板培養基置于培養箱內，保持溫度25 ℃，待菌絲長滿平板后備用。

2.2 液體種的制備

按照1.2的不同培養基配方制備液體培養基，調節到pH6.5。將制備好的液體培養基導入500 mL三角瓶內，每瓶200 mL，將倒好培養基的三角瓶放入121 ℃高壓滅菌鍋內滅菌30 min。滅菌的液體培養基冷卻至室溫，在無菌操作臺中，將平板培養基用打孔器在同一半徑上取菌，接種到液體培養基中,每瓶3個菌塊兒。將接種好的液體培養基封好封口膜，靜置24 h后放入恒溫培養箱中，以25 ℃，150 r·min-1，避光培養10 d。

2.3 菌球數量及干質量的測定

分別在每種液體培養基中取出100 mL菌液，計算菌絲球的數量。重復3次取平均值。

將菌絲培養液3 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入等體積蒸餾水，搖勻后3 000 r·min-1離心10 min，重復3次。將分離出的菌絲放入50 ℃的恒溫鼓風干燥箱內烘干至恒質量，用電子天平稱質量。

2.4 葡萄糖標準曲線的繪制

將葡萄糖標準品置于100 ℃的烘箱內烘干至恒質量，準確稱取葡萄糖純品100 mg，加蒸餾水溶解后加入5 mL鹽酸，定容至1 000 mL容量瓶中，得到葡萄糖標準液。精密吸取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，分別置于試管中，分別加入蒸餾水補至2 mL，依次加入6%的苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL。室溫放置10 min，冷卻后用分光光度計在490 nm處測定吸光度，用蒸餾水做對照。以葡萄糖濃度為橫坐標對吸光度值回歸，求得標準曲線的回歸方程。

2.5 胞內粗多糖含量的測定

胞內粗多糖的提取：將烘干至恒質量的羊肚菌菌絲研磨成細粉，過200目篩備用。稱取羊肚菌菌絲1 g，置于離心管中，加入30倍體積的蒸餾水搖勻，放入超聲儀器中50 ℃超聲30 min。超聲后立即以5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，重復3次，旋轉蒸發濃縮至10 mL，加入40 mL無水乙醇震蕩搖勻，然后置于4 ℃下沉淀12 h，沉淀后放入離心機5 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，用丙酮洗滌后將沉淀物置于50 ℃的烘箱中烘干至恒質量，即得羊肚菌粗多糖，將得到的粗多糖定容至1 L。羊肚菌胞內粗多糖含量的測量方法同2.4，計算羊肚菌多糖的含量。用公式y=m/M×100%，得出胞內多糖得率，式中：y-羊肚菌胞內多糖得率(%)；m-胞內多糖質量(g)；M-菌絲體的質量(g)。

3 試驗結果

3.1 葡萄糖標準曲線

根據吸光度值繪制出來葡萄糖標準曲線，標準曲線表現出了很好的線性關系，圖中橫坐標為多糖的濃度(mg·mL-1)，縱坐標為吸光度(A)，得標準曲線回歸方程y=15.885 x+0.010 4，R2=0.998 5。

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 不同液體培養基對羊肚菌菌球生長的影響

根據表1所示，不同培養基配方的100 mL培養基中菌球個數的比較結果為Y4>Y3>Y1>Y2>Y5;菌絲干質量的比較結果為Y4>Y3>Y2>Y1>Y5。可見，無論是菌球個數還是菌絲的質量，Y4培養基都是最利于菌球生長的液體培養基，Y4培養基中菌絲球的個數為95個·(100 mL)-1，菌絲干質量為10.24 g·L-1，菌絲個數是Y5培養基的10.6倍，菌絲干質量是Y5培養基的5.6倍。

表1 不同液體培養基對羊肚菌菌球生長的影響

3.3 不同液體培養基對羊肚菌菌絲粗多糖得率的影響

由表2可知，不同培養基的多糖得率從大到小分別是Y4、Y3、Y2、Y5、Y1。Y4培養基的粗多糖得率最高為11.45%，是粗多糖得率最低的Y1培養基的5倍。

表2 不同液體培養基對羊肚菌菌絲粗多糖含量的影響

試驗表明Y4培養基無論從菌絲生物量還是多糖得率方面均是最高的，且又是顯著。

4 結果與討論

本試驗以5種不同的液體培養基配方(Y1：麥麩、黃豆粉；Y2：馬鈴薯黃豆粉；Y3馬鈴薯、酵母膏；Y4麥麩、酵母膏；Y5米糠、黃豆粉)對羊肚菌進行液體培養，試驗表明，Y4培養基中菌球大小均勻、個數多，菌絲生物量最大，菌絲粗多糖得率最高。有研究表明，麥麩中含有豐富的氨基酸、維生素E、維生素B族和胡蘿卜素等[14]，以麥麩、酵母膏為培養基質，為羊肚菌提供了優質豐富的碳氮源，這些碳氮源可以被羊肚菌菌絲體直接利用[15]。因此，本研究用麥麩、酵母膏培養液體羊肚菌可得到較多的菌球，菌絲的生長量也高。

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Selection of Liquid Culture Medium ofMorehellaesculenta

Cheng Yuan

(Baolongdian Seed Forest Farm,Wuchang City,Harbin 150200,China)

Morehellaesculentawas conducted liquid culture by five different liquid culture recipes (Y1: wheat bran, soybean powder; Y2: potato, soybean powder; Y3: potato, yeast extract; Y4: wheat bran, yeast extract; Y5: rice bran, soybean powder).Result shows that size of bacteria in Y4 medium is uniform, the number is 95·(100 mL)-1, the biomass of mycelial is 10.24 g·L-1, the highest rate of mycelial polysaccharide is 11.45%, indicating that the medium of wheat bran and yeast extract are the optimal medium among five kinds of medium.

Morehellaesculenta; liquid culture medium; selection

1005-5215(2017)08-0048-03

2017-05-25

程遠(1982-)，男，黑龍江巴彥人，大學，工程師，從事小漿果及食用菌等培養研究.

S723.132.6

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.07.015