三株雞源大腸桿菌iss基因的檢測

摘要：采用雞胚致死對HL11、HL32、SD27雞源大腸桿菌（Escherichia coli）的致病性進行測定，并檢測其血清抗性及iss基因序列。結果表明，3株大腸桿菌為致病性、血清補體敏感菌株，iss基因序列與已知禽大腸桿菌iss基因序列同源性為99.0%～99.7%。

關鍵詞：雞源大腸桿菌（Escherichia coli）；iss基因；致病性；血清抗性

中圖分類號：S831 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5969-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.060

Detection of iss Gene of Three Avian E.coli Strains

FAN Chen1，XU Wang-ye2，ZENG Qing-hua1，WANG Hui1，LI Yan1，WANG Lei1，GUO Xing-feng1

（1.Agricultural School，LiaoCheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：The virulence of avian E.coli strains HL11，HL32，SD27 were detected by embryo lethality assay. The presence of iss gene and complement resistance were tested. Results showed that three strains are pathogenic and complement sensitive. The iss sequences have 99.0%～99.7% identity with reference sequence.

Key words：avian E.coli； iss gene； virulence； complement resistance

大腸桿菌（Escherichia coli）是食品污染程度的重要指標，某些血清型的大腸桿菌對人類和動物具有致病性，對嬰幼兒以及家禽尤為明顯[1，2]。大腸桿菌病為人畜共患病，受到大腸桿菌污染的食物被食用后，可以導致食物中毒甚至是嚴重的敗血癥，并增加其他病原體感染機會，如痢疾、霍亂或者傷寒等腸道疾病，對食品安全有較大影響[2-4]。大腸桿菌的血清型繁多，但不同血清型的大腸桿菌有共同的致病物質基礎[4，5]。研究發現，與大腸桿菌毒力相關的致病因子有1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質粒、補體抗性、鐵轉運系統等[6-9]。

在大腸桿菌諸多致病因子中，菌毛在致病性大腸桿菌侵入機體，并在體內定居、增殖、釋放毒力因子的過程中起著重要的作用。但細菌進入機體血流后，將面對血液中的殺菌物質，如補體等。細菌抵抗血液中殺菌物質的能力，對細菌致病力有重要影響。研究表明，iss基因（Increased serum survival gene，iss gene）存在于ColV質粒上，iss基因編碼的蛋白Iss屬于外膜蛋白的一部分，與細菌抗補體作用有關，可增強大腸桿菌的血清抗性[10]。本試驗對雞源大腸桿菌HL11、HL32、SD27進行了致病性檢測，并對iss基因進行序列測定，探討iss基因序列與大腸埃希菌致病力的相互關系，為iss基因作為毒力標志基因在大腸桿菌毒力判定、食品安全檢測中的應用等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HL11、HL32為東北農業大學動物醫學學院分離，30%甘油-20 ℃保存；SD27為聊城大學農學學院分離，30%甘油-20 ℃保存。

1.1.2 引物 參考GenBank中的禽大腸桿菌iss基因核苷酸序列（登入號：AF042279）設計兩對引物。引物1上游：5’agctatcgtttaattattatcac3’；引物1下游5’gtagggagcccagaagtat3’；引物2上游：5’cgcggatccag

gattctgccgttttta3’；引物2下游：5’cgcgtcgaccatatcgatggg

caacta3’[11]。

1.1.3 試劑 伊紅美藍培養基、麥康凱培養基、營養肉湯培養基、生化試驗鑒定管等購自青島海博生物技術有限公司。蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、pMD18-T克隆載體及相關試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的活化 無菌條件下將樣本分別接種于伊紅美藍培養基置37 ℃恒溫箱培養24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤的菌落于麥康凱瓊脂平板，繼續培養24 h。挑取麥康凱瓊脂平板上桃紅色典型菌落。進行革蘭氏染色鏡檢，取另一半接種于LB普通營養斜面培養基恒溫培養箱37 ℃培養24 h，用于生化鑒定。

1.2.2 生化鑒定 取細菌純培養物分別接種于吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗管中，并進行三糖鐵試驗、尿素酶試驗、觸酶試驗、半固體營養瓊脂穿刺試驗、淀粉試驗，其中觸酶試驗立刻觀察，其他試驗分別置37 ℃溫箱搖床培養。吲哚試驗、MR試驗、尿素酶試驗、半固體營養瓊脂穿刺試驗、淀粉試驗于24 h觀察，VP試驗于48 h滴加試劑觀察，枸櫞酸鹽試驗于96 h觀察。取細菌純培養物接種6種糖類微量發酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖發酵管），置37 ℃培養24～48 h后進行觀察。

1.2.3 對雞胚的致病性試驗 將待測菌接種于LB液體培養基，37 ℃培養過夜。收集細菌用PBS溶液洗2次，并用PBS溶液倍比稀釋。取0.1 mL稀釋液經尿囊腔注射12日齡SPF雞胚，大約100～300 CFU，每組10只。同時取0.1 mL稀釋液涂板，做細菌計數。對照組分兩組，一組注射PBS溶液，一組不注射。每日檢蛋，記錄每日死亡數，至第四天，計算胚胎致死率。

1.2.4 擴增模板制備 將待測菌劃板，挑取平板上的單菌落，加入40 μL lysing Buffer（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，1 mmol/L EDTA）和蛋白酶K（終濃度為50 μg/mL），混勻，置于55 ℃溫育10 min后再置80 ℃溫育10 min，最后加80 μL滅菌三蒸水，-20 ℃保存。

1.2.5 iss基因的PCR擴增 PCR擴增反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各1 μL，DNA模板 5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL，rTaq酶 0.5 μL，共50 μL。PCR擴增反應程序：97 ℃預變性5 min；97 ℃變性1 min，47 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸30 s，9個循環；再經95 ℃變性1 min， 48 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃延伸10 min。然后再進行套式PCR擴增反應，套式PCR擴增反應體系同上，PCR擴增反應程序： 95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃退火30 s，28個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.6 iss基因鑒定 實驗室常規方法純化PCR產物，并進行序列測定。

1.2.7 血清抗性檢測 細菌培養至對數期，OD600 nm=0.5，相應于10個細菌數/mL；于0.06 mmol/L NaCl中洗3次，重懸于0.9%NaCl至106個活菌數/mL；將細菌懸液與雞血清相混合，使血清終濃度為80%；混合物于37 ℃溫育，分別于0、2 h取樣，用鹽溶液稀釋后涂板，37 ℃培養18 h，計活菌數。計算菌株2 h時活菌數與0 h時活菌數的對數差，判定菌株血清抗性強弱。

2 結果與分析

2.1 細菌生化鑒定結果

在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在麥康凱瓊脂上形成圓形、中等大小均一，表面光滑濕潤中央輕微隆起、桃紅色菌落；在營養瓊脂上37 ℃培養24～48 h后，形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明灰白色菌落；在SS瓊脂上生長較差，呈粉紅色。在肉湯中培養18～24 h，呈均勻混濁，管底有灰白色黏性沉淀。革蘭氏染色可見兩端鈍圓、多數散在排列、革蘭氏陰性短桿菌。葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇發酵試驗均產酸產氣；MP、吲哚試驗，淀粉試驗、觸酶試驗、動力試驗呈陽性；枸櫞酸鹽試驗、尿酶試驗、VP、蔗糖發酵試驗呈陰性；三糖鐵試驗符合大腸桿菌特征，無H2S產生。

2.2 胚胎致死及血清抗性鑒定結果

雞胚接種細菌后，各試驗組在觀察期內均有死亡，而對照組無死亡。菌株在終濃度為80%的含補體雞血清中溫育，2 h與0 h的活菌對數差為-5.37至-4.67，3株菌株為致病性大腸桿菌及補體敏感菌株，具體結果見表1。

2.3 iss基因序列鑒定結果

套式PCR特異性擴增產物大小為309 bp的核苷酸序列，如圖1所示。3條序列由上至下分別為HL11、HL32、SD27菌株iss基因核苷酸序列。iss基因核酸序列用DNAStar軟件進行比對，與參考序列比較，HL11的同源性為99.7%，HL32的同源性為99.4%，SD27的同源性為99.0%。3條序列預測編碼Iss蛋白的氨基酸序列，HL11第35位由丙氨酸變為纈氨酸；HL32的82位亮氨酸變為苯丙氨酸、第88位苯丙氨酸變為亮氨酸；SD27氨基酸序列與參考序列一致。

3 小結與討論

雞大腸桿菌HL11、HL32、SD27雞胚致死率分別為50%、60%、30%，雞胚致死率低于15%判為無致病性/低致病性[9]，因此3株菌株均判斷為致病性菌株。但其血清抗性試驗中，2 h與0 h的活菌對數差均低于-2.12[11]，判定為血清敏感菌株。iss基因序列分析結果表明，HL11、HL32、SD27菌株iss基因序列與禽大腸桿菌iss基因參考序列同源性達99.0%～99.7%，個別位點存在核苷酸差異。HL11、HL32、SD27菌株為致病性菌株，血清補體敏感，且iss基因在核苷酸序列上與已知強毒株存在差異。3株菌株在血清抗性、致病性方面與參考序列菌株O2的差異，是否與iss基因的變異有關還需要更多菌株的iss基因檢測進一步探討。

正常機體具有抗病原微生物侵襲的能力。致病性大腸桿菌要發揮其致病作用，必須首先突破機體的天然屏障，即首先在局部吸附并定居繁殖，進而侵入體內，因此大多數研究基于大腸桿菌菌毛的研究。但細菌定居后不斷增殖形成集落（局部增殖），在條件適合時侵入機體組織，并進入血流。大腸桿菌從肺泡毛細血管進入血循環，引起菌血癥；在全身組織內增殖，當機體抵抗力降低時，大腸桿菌大量繁殖，引起敗血癥。補體在機體血液中發揮殺菌作用，細菌的補體抗性與毒力高度相關，是重要的致病因素[8，9]。對iss基因序列及基因拷貝水平的進一步研究可能揭示大腸埃希菌iss基因在致病力及血清補體抗性方面的作用。

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