蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性基線

摘要：采用菌絲生長速率法測定了蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）對甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果顯示，EC50處于0.206 7～9.066 5 mg/L之間，平均為3.883 6±2.097 9 mg/L，與甲基硫菌靈對5個野生海棠菌株的EC50平均值3.041 3±0.296 5 mg/L無明顯差異。正態(tài)檢驗表明，76個蘋果輪紋病菌菌株對甲基硫菌靈的敏感性符合近似正態(tài)分布，山東省未出現(xiàn)產(chǎn)生抗藥性的蘋果輪紋病菌菌株，EC50平均值3.883 6±2.097 9 mg/L可作為蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性基線。

關鍵詞：蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）；甲基硫菌靈；敏感性基線

中圖分類號：S482.28 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5825-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.024

Sensitivity Baseline of Botryosphaeria dothidea from Apple to Thiophanate-methyl

LIU Bao-you， ZHANG Wei， LUAN Bing-hui， WANG Ying-zi

（Institute of Plant Protection， Yantai Academy of Agricultural Sciences of Shandong Province， Yantai 265500，Shandong， China）

Abstract： Sensitivity in Botryosphaeria dothidea to thiophanate-methyl was determined by mycelium growth rate method in fungicide-amended media. 50% effective concentration（EC50） of thiophanate-methyl were between 0.206 7 mg/L and 9.066 5 mg/L and the mean EC50 was 3.883 6±2.097 9 mg/L. The mean EC50 for 5 white rot isolates of Chinese flowering crabapple without a previous history of fungicide exposure to thiophanate-methyl was 3.041 3±0.296 5 mg/L，which was not distinct from 3.883 6±2.097 9 mg/L. Normal distribution analysis showed that the sensitivity of isolates to thiophanate-methyl was fitted well with a normal distribution function. So far， resistance to thiophanate-methyl was not found in 76 isolates collected in Shandong province. The mean EC50 of 3.883 6±2.097 9 mg/L was made as sensitivity baseline of B. dothidea from apple to thiophanate-methyl.

Key words： Botryosphaeria dothidea； thiophanate-methyl； sensitivity baseline

由蘋果輪紋病菌[Botryosphaeria dothidea（Moug.）Ces. De Not]引起的蘋果輪紋病主要分布于中國、韓國、日本。中國蘋果主產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，山東各地蘋果園普遍發(fā)生。該病在山東省具有加重的趨勢，嚴重發(fā)病園發(fā)病率達40%以上，主要為害果實和枝干，且在果實儲藏期仍可發(fā)病，危害嚴重[1]。在防治病害方面，化學殺菌劑仍是當前防治蘋果輪紋病的主要手段。甲基硫菌靈為防治蘋果輪紋病的重要藥劑，該藥劑具有保護、治療、內(nèi)吸三大功效，因其殺菌譜廣、防治效果好而被廣泛使用。但由于其作用位點單一，長期連續(xù)使用，加速了不同病原菌對甲基硫菌靈的抗藥性。據(jù)報道，蘋果褐斑病菌（Diplocarpon mali）[2]、冬麥雪腐病菌（Gerlachia nivalis）[3]、麥赤霉病菌（Fusarium culmorum）[4]、梨黑星病菌（Venturia nashicola）[5，6]、草坪菌核幣斑病菌（Sclerotinia homoeocarpa）[7]、西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）[8]等病原菌已對甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗藥性。目前，蘋果輪紋病菌已對苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑[9]、戊唑醇[10]等殺菌劑產(chǎn)生低水平抗藥性，但未見有蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈敏感性的研究報道。本研究旨在通過采集山東省不同地區(qū)的蘋果輪紋病菌，了解蘋果輪紋菌株對甲基硫菌靈的抗藥性現(xiàn)狀，為病害的綜合治理提供基本理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2007～2008年分別從山東省濟南、煙臺、威海、淄博等17個地區(qū)蘋果園采集典型輪紋病樣本300余份。經(jīng)組織分離、純化及鑒定，保存菌株272個。挑選76個典型菌株，評價病菌對甲基硫菌靈的敏感性。2009年從未施過甲基硫菌靈的海棠上獲取5個野生輪紋菌株，作為參照菌株。

1.2 供試藥劑

98%甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）原藥，新加坡生達有限公司生產(chǎn)。用少量丙酮溶解后加入0.1%的吐溫-80水溶液，配成濃度為10 000 mg/L的母液。

1.3 試驗方法

1.3.1 含甲基硫菌靈的PDA培養(yǎng)基 用Eppendorf微量移液器吸取1 mL的甲基硫菌靈母液，用滅菌水配成系列稀釋液。將溶化的PDA培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃，用微量移液器分別將上述稀釋液加入到 49 mL PDA培養(yǎng)基中，配成終濃度分別為50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/L的含藥培養(yǎng)基平板。

1.3.2 生長速率法[11] 在PDA培養(yǎng)基上將病原菌培養(yǎng)5 d，自菌落邊緣取6 mm的菌餅，用接種針將菌餅接種于含藥平板中央，置于26 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，5 d后測定菌落生長量。設不含藥劑的處理為空白對照，每處理重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用卡尺準確測量菌落直徑（mm），采用十字交叉法垂直測量直徑各一次，求其平均值，減去6 mm菌餅直徑，即為菌落生長直徑。再根據(jù)3次重復試驗結(jié)果，求出各濃度梯度的平均直徑，計算不同濃度梯度的菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=

■×100%

用各濃度梯度對數(shù)值及相應的菌絲生長抑制率作回歸分析，計算甲基硫菌靈對不同蘋果輪紋菌株的EC50、EC90和相關系數(shù)，并應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

采用菌絲生長速率法測定了76個蘋果輪紋菌株對甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果表明，甲基硫菌靈對蘋果輪紋病菌的菌絲生長具有明顯的抑制效果。EC50處于0.206 7～9.066 5 mg/L范圍之內(nèi)，平均為3.883 6±2.097 9 mg/L，EC90平均為25.218 4±11.660 6 mg/L。根據(jù)EC50極差R=maxx-minx=9.066 8-0.206 7=8.860 1 mg/L，將處于0～10之間的EC50數(shù)據(jù)分成10組，具體分組中值、頻數(shù)見圖1。

圖1中的曲線代表了蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性狀況，呈單峰曲線分布；通過K-S正態(tài)性檢驗，得Z=0.523，雙側(cè)檢驗P=0.947>0.05，EC50頻數(shù)分布表現(xiàn)連續(xù)性。結(jié)果表明，甲基硫菌靈對76個蘋果輪紋菌株的EC50頻數(shù)分布曲線符合近似正態(tài)分布。

為了確定多年來甲基硫菌靈對蘋果輪紋病菌的影響，將5個野生海棠輪紋病菌菌株作為參照菌株。結(jié)果表明，甲基硫菌靈對其的EC50（表1）與蘋果輪紋病菌的EC50（表2）無明顯差異。蘋果輪紋病菌自然種群中不存在抗藥性的菌株，病原菌仍處于原始種群。本研究測定的76個菌株對甲基硫菌靈的EC50平均值為3.883 6±2.097 9 mg/L，可作為蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性基線。

3 小結(jié)與討論

甲基硫菌靈自應用于防治蘋果輪紋病等多種病害以來，對促進農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)起到了十分重要的作用。但因其作用位點單一，許多作物病害對甲基硫菌靈已產(chǎn)生了抗藥性[2-10]。本研究結(jié)果表明，甲基硫菌靈對76個蘋果輪紋病菌EC50的頻數(shù)呈近似正態(tài)分布，可將EC50頻數(shù)分布圖及其平均值3.883 6±2.097 9 mg/L作為蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性基線，為今后田間抗藥性菌株的監(jiān)測提供參考依據(jù)。

盡管連續(xù)幾十年應用甲基硫菌靈防治蘋果輪紋病，但未出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象。這表明目前該藥劑防治蘋果輪紋病具有較低的風險性。但這并不意味著蘋果輪紋病菌不會對甲基硫菌靈產(chǎn)生抗藥性，因此生產(chǎn)上需注意藥劑的合理搭配使用。

參考文獻：

[1] 國立耘，李金云，李保華，等.中國蘋果枝干輪紋病發(fā)生和防治情況[J].植物保護，2009，35（4）：120-123.

[2] TANAKA S，KAMEGAWA N，ITO S，et al. Detection of thiophanate-methyl-resistant strains in Diplocarpon mali，causal fungus of apple blotch[J].J Gen Plant Pathol，2000，66（1）：82-85.

[3] TANAKA F，SAITO I，MIYAJIMA K，et al. Occurrence of thiophanate-methyl tolerant isolates of Fusarium nivale（=Gerlachia nivalis），a causal fungus of snow mold of winter wheat，in Japan[J].Ann Phytopath Soc，1983，49：565-566.

[4] IWAMA T，KATSUBE K，ISHII H. Detection of thiophanate-methyl-resistant isolates of Fusarium culmorum，a causal agent of Fusarium head blight on wheat，in Aomori Prefecture，northern Japan[J].Jpn J Phytopathol，2007，73：162-165.

[5] ISHII H，YAMAGUCHI A. Reisistant of Venturia nashicola to thiophanate-methyl and benomyl： Existence of weakly resistant isolates and its practical significance[J].Ann Phytopath Soc Japan，1981，47：528-533.

[6] ISHII H，UDAGAWA H，YANASE H，et al. Resistance of Venturia nashicola to thiophanate-methyl and benomyl：Build-up and decline of resistance in the field[J].Plant Pathol，1985， 34（3）：363-368.

[7] BISHOP P，SOROCHAN J C，OWNLEY B H，et al. Resistance of Sclerotinia homoeocarpa to iprodione，propiconazole，and thiophanate-methyl in Tennessee and Northern Mississippi[J].Crop Sci，2008，48：1615-1620.

[8] KEINATH A P，ZITTER T A. Resistance to benomyl and thiophanate-methyl in Didymella bryoniae from South Carolina and New York[J].Plant Disease，1998，82（5）：479-484.

[9] 劉保友，張 偉，欒炳輝，等.蘋果輪紋病菌對苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑的敏感性及其交互抗性[J].植物病理學報，2013，43（5）：541-548.

[10] 王英姿，張 偉，劉保友，等.山東省蘋果輪紋病菌對戊唑醇的抗藥性及其地理分布[J].果樹學報，2010，27（6）：961-964.

[11] 慕立義.植物化學保護研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994.