腦膠質瘤1H-MRS膽堿相對值與腫瘤增殖抗原Ki-67表達的關系

胡麗娟，廖凱兵

（湖北省中西醫結合醫院放射科，湖北 武漢 430015）

?中樞神經影像學?

腦膠質瘤1H-MRS膽堿相對值與腫瘤增殖抗原Ki-67表達的關系

胡麗娟，廖凱兵

（湖北省中西醫結合醫院放射科，湖北 武漢 430015）

目的：用3.0T多體素1H-MRS分析腦膠質瘤氫質子磁共振波譜表現，探討低、高級別膠質瘤膽堿相對值（Cho/Cr）與腫瘤增殖抗原Ki-67表達的關系。方法：經病理證實的腦膠質瘤患者57例，其中低級別膠質瘤（Ⅰ、Ⅱ級）28例，高級別膠質瘤（Ⅲ、Ⅳ級）29例；所有患者在術前行3.0T1H-MRS檢查，檢測腫瘤實質部分Cho/Cr值，分析Cho/Cr值與膠質瘤病理級別的關系；術后病理切片行Ki-67免疫組織化學染色，測定Ki-67標記指數（Ki-67LI），分析Ki-67LI與膠質瘤病理級別及Cho/Cr值的相關性。結果：①低、高級別膠質瘤腫瘤實質部分Cho/Cr比值差異有統計學意義（P<0.001），腦膠質瘤腫瘤實質部分的Cho/Cr比值與腫瘤級別呈顯著正相關（r=0.616，P<0.001）。Cho/Cr的ROC曲線下面積為0.856，取Cho/Cr=2.44為閾值鑒別不同級別腦膠質瘤，其敏感性為79.3%，特異性為82.1%。②低級別膠質瘤Ki-67LI為 （3.41±2.35）%，高級別膠質瘤Ki-67LI為 （19.78±11.45）%，兩者差異有統計學意義（Z=-0.617，P<0.001）；Ki-67LI與膠質瘤病理級別呈顯著正相關（r=0.804，P<0.001），與 Cho/Cr值呈顯著正相關（r=0.490，P<0.001）。結論：腦膠質瘤Cho/Cr值與Ki-67的表達具有相關性，可作為術前無創評價腫瘤細胞增殖活性及惡性程度的影像學指標，有利于臨床治療方案的選擇及預后的評估。

神經膠質瘤；Ki-67抗原；磁共振成像

腦膠質瘤來源于神經膠質細胞，是最常見的原發中樞神經系統腫瘤，發病率較高[1]。雖然膠質瘤的治療方法已經由過去單一的手術切除發展到現在的手術聯合放、化療等綜合治療，但仍有許多患者預后不佳。其中一個最根本的原因是部分膠質瘤具有侵襲性生長的特征，容易引起術后復發。因此，如何更準確地評價膠質瘤的惡性度已成為臨床選擇治療方案及評估預后的關鍵。常規MRI對膠質瘤診斷價值有限，多體素氫質子磁共振波譜（1H-MRS）能在體、無創地分析膠質瘤的組織代謝信息，其中膽堿（Cho）是膠質瘤的主要代謝產物，其與細胞膜合成及降解有關，當細胞分裂增殖旺盛時可引起Cho含量的升高[2]。Ki-67是反映腫瘤細胞增殖活性的標志物之一[3]，Ki-67高表達的腫瘤細胞增殖速度快，侵襲性強，預后差。目前將波譜技術與分子病理標志物聯合應用于膠質瘤的研究較少，因此，本研究旨在探討不同病理級別膠質瘤波譜膽堿相對值（Cho/Cr）與Ki-67表達的關系，以期使磁共振波譜成為評價膠質瘤增殖活性的可靠影像學指標，實現活體、無創預測膠質瘤的生物學行為，為指導臨床治療及判斷預后提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 一般資料

搜集2014年1月—2016年2月我院行MR檢查的膠質瘤患者57例，男34例，女23例，年齡6～65歲，平均41.2歲。主要臨床癥狀有頭痛、頭暈、嘔吐、抽搐、肢體乏力、語言不清、視力下降等。按WHO 2007年膠質瘤分類分級標準，低級別膠質瘤28例，高級別膠質瘤29例，均經術后病理證實。在接受MR檢查前，所有患者均未接受化療及放療，無腦外傷及腦手術史。所有檢查均獲得患者及家屬知情同意。

1.2 常規MR及1H-MRS檢查方法

使用GE Signa EXCITE 3.0T超導核磁共振儀，頭頸聯合線圈。所有患者先行軸位、矢狀位平掃，T1WI：TR 2 300 ms，TE 22 ms；T2WI：TR 5 100 ms，TE 110 ms，層厚5 mm，間距1.2 mm。隨后進行多體素1H-MRS掃描，根據T2WI上的腫瘤信號特征，選取腫瘤最大面積層面為掃描興趣區 （ROI），ROI包括腫瘤實質區及對側正常組織，盡量避開骨骼、脂肪及含腦脊液區域。采用點分辨波譜（PRESS）技術，TR 1 000 ms，TE 144 ms， 成像時間 325 s。 最后行MR增強掃描。造影劑為歐乃影（釓雙胺注射液），通用電氣藥業（上海）有限公司生產，經肘靜脈注射，劑量為0.2 mmol/kg。

1.3 圖像后處理及數據分析

將波譜檢查獲得原始圖像傳送至GE AW 4.5工作站，用Func Tool軟件進行分析，在波譜定位圖上選擇ROI，選擇標準如下：①正常組織：在T1WI、T2WI上均呈正常信號且無異常強化的區域。②腫瘤實質：有或無異常強化的邊界清楚的實質結構，T2WI呈高信號。對于有強化者，可將腫瘤實質的測量區域設定在強化最明顯部分；對于無明顯強化者，可選擇T2WI高信號及腫瘤占位效應明顯的部分為腫瘤實質區。將體素（體素大小為1 cm×1 cm×1 cm）分別置于上述不同部位，在波譜圖上觀察代謝物的變化情況，儀器自帶軟件計算出膽堿復合物（Cho，3.2 ppm）、肌酸復合物（Cr，3.02 ppm）的波峰下面積，所得數值代表各代謝物的濃度，同時以Cr為內標準進行定量分析，測量腫瘤組織及對側正常組織的Cho/Cr比值。每組比值均測量3次取平均值，以減少誤差。

1.4 Ki-67免疫組化染色及結果判斷

術后標本以10%甲醛固定24 h后，行免疫組化染色。使用Ki-67鼠抗人單克隆抗體，Envision二步法，按說明書操作，陽性對照使用已知的腫瘤陽性標本，PBS代替一抗作陰性對照，所有試劑均來自福州邁新生物技術開發有限公司。以細胞核中觀察到棕黃色顆粒為Ki-67陽性細胞，高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，總共計數1 000個細胞，計算Ki-67陽性細胞百分數，即Ki-67標記指數（Ki-67LI）。

1.5 統計學分析

統計學分析使用IBM SPSS 17.0軟件，計量資料以±s表示。各組資料行正態分布檢驗，對不符合正態分布的資料采用非參數統計分析。采用t檢驗比較低、高級別膠質瘤Cho/Cr值差異；采用Mann-Whitney U檢驗比較低、高級別膠質瘤Ki-67LI的差異；采用Spearman相關分析探討各指標之間的相關性；采用受試者操作特征（ROC）曲線分析Cho/Cr值對膠質瘤分級診斷的敏感性、特異性及最佳診斷閾值。以α=0.05作為檢驗水準，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

57例膠質瘤均表現為Cho/Cr比值較對側升高，其中高級別膠質瘤升高更明顯，低、高級膠質瘤腫瘤實質部分Cho/Cr比值差異有統計學意義 （P<0.05），見表1和圖1，2。腦膠質瘤腫瘤實質部分的Cho/Cr比值與腫瘤級別呈顯著正相關 （r=0.600，P<0.001），見表2。ROC曲線分析顯示，Cho/Cr的ROC曲線下面積為0.856（P<0.001），說明其用于膠質瘤分級的診斷效能較高，選擇約登指數 （Youden index）最大時對應的代謝物比值為最佳界值，Cho/Cr區分不同級別膠質瘤的最佳界值為2.44，敏感性為79.3%，特異性為82.1%。見圖3。

表1 高、低級別膠質瘤腫瘤實質部分Cho/Cr比值及Ki-67LI比較

表2 Cho/Cr比值及Ki-67LI與膠質瘤病理級別的相關性分析

57例膠質瘤Ki-67抗原均呈陽性，低級別膠質瘤Ki-67陽性細胞分布稀疏，染色較淺；高級別膠質瘤Ki-67陽性細胞分布密集，染色深，見圖1，2。低級別膠質瘤 Ki-67LI為（3.41±2.35）%，高級別膠質瘤Ki-67LI為（19.78±11.45）%，兩者差異有統計學意義（Z=-0.617，P<0.001），見表 1。 Spearman 相關分析顯示，Ki-67LI與膠質瘤病理級別呈顯著正相關 （r=0.804，P<0.001）， 與 Cho/Cr值呈顯著正相關 （r=0.490，P<0.001），見表 2。

圖1 膠質母細胞瘤WHOⅣ級。圖1a：MRS橫斷位T2WI定位圖。圖1b：腫瘤組織波譜圖，顯示Cho明顯升高，NAA及Cr明顯下降，Cho/Cr=4.07。圖1c：Ki-67免疫組化染色，Ki-67陽性細胞彌漫分布，陽性表達率約40%。Figure 1. Glioblastoma(WHO gradeⅣ).Figure 1a:Scout axial T2WI image of MRS.Figure 1b:MR spectra of solid area shows significant elevation of Cho and significant decrease of NAA and Cr,Cho/Cr=4.07.Figure 1c:Ki-67 immunohistochemical staining,Ki-67 positive cells show diffuse distribution,with the positive rate of 40%.

圖2 星形細胞瘤WHOⅡ級。圖2a：MRS橫斷位T2WI定位圖。圖2b：腫瘤組織波譜圖，顯示Cho中度升高，NAA及Cr中度下降，Cho/Cr=1.74。圖2c：Ki-67免疫組化染色，Ki-67陽性細胞散在分布，陽性表達率約3%。Figure 2.Astrocytoma(WHO gradeⅡ).Figure 2a:Scout axial T2WI image of MRS.Figure 2b:MR spectra of solid area shows moderate elevation of Cho and moderate decrease of NAA and Cr,Cho/Cr=1.74.Figure 2c:Ki-67 immunohistochemical staining,Ki-67 positive cells Ki-67 positive cells are scattered distribution,with the positive rate of 3%.

圖3 膠質瘤腫瘤實性部分Cho/Cr值ROC曲線，AUC=0.856，Cho/Cr=2.44，敏感性為79.3%，特異性為82.1%。Figure 3.ROC curve of Cho/Cr,AUC=0.856,the threshold value of Cho/Cr is 2.44,the sensitivity is 79.3%,the specificity is 82.1%.

3 討論

腦膠質瘤是最常見顱內原發腫瘤，其發生發展較為復雜，受多個基因及因素的影響。惡性膠質瘤具有侵襲性強、易復發、致殘致死率高的特點，治療難度大，預后差。因此，術前準確判斷膠質瘤的增殖活性是非常重要的。活檢雖然是獲得膠質瘤增殖情況的金方法，但活檢的有創性及并發癥是其不可避免的弊端。多體素1H-MRS能評價膠質瘤腫瘤細胞的代謝情況，使得術前在體、無創預測膠質瘤的增殖活性成為可能。

本研究中，57例膠質瘤腫瘤實質區的1H-MRS均表現為Cho峰升高，相應的Cho/Cr比值升高，與文獻報道一致[4]。膠質瘤的各代謝產物中，Cho是與細胞膜合成及降解相關的化合物，當細胞分裂增殖旺盛時可引起Cho含量的升高[5]。膠質瘤Cho顯著升高，提示腫瘤細胞分裂增殖活躍。目前的研究[6]普遍認為Cho含量與腫瘤惡性程度呈正比，腫瘤的惡性程度越高，腫瘤細胞增殖活性越強，細胞膜轉化速度越快，相應Cho峰升高越明顯。項威等[7]對27例膠質瘤患者行MRS檢查顯示，高級別膠質瘤Cho/Cr比值明顯高于低級別膠質瘤，說明高級別膠質瘤由于細胞增殖速度快，引起的代謝異常變化更顯著。樓曉劍等[8]對45例星形細胞瘤的研究也發現，Cho/Cr比值高級別組明顯高于低級別組，Cho/Cr比值與腫瘤級別正相關。本研究顯示，高、低級別腦膠質瘤均可出現Cho峰升高，但高級別腦膠質瘤Cho/Cr比值較低級別腦膠質瘤升高更顯著，低、高級別腦膠質瘤腫瘤實質部分Cho/Cr比值差異有統計學意義，且Cho/Cr比值與膠質瘤病理級別顯著正相關，說明隨著腫瘤級別增加，細胞增殖速度更快，侵襲性更強，與上述文獻報道一致。本研究發現，Cho/Cr的ROC曲線下面積為0.856，說明Cho/Cr可作為膠質瘤分級診斷的可靠指標。取Cho/Cr=2.44為閾值鑒別不同級別腦膠質瘤，其敏感性為79.3%，特異性為82.1%。 Zeng等[9]研究發現，取 Cho/Cr值為 2.04時，鑒別不同級別膠質瘤的敏感性為84%，特異性為83.33%。本組結果與其稍有出入，推測可能為樣本組成不同或ROI的選擇差異等因素所致。

Ki-67是一種特異性表達于細胞增殖期的核抗原，由兩條多肽鏈組成，相對分子量分別為345 KD及395 KD，是目前評價細胞增殖活性最可靠的指標之一[10-11]，基因定位于人10號染色體長臂（10q25）。Ki-67 只表達于細胞周期的 G1、S、G2、M 期，G0期不表達。在G1中晚期開始出現在核仁周圍，S期和G2期表達逐漸升高，至M期達到峰值，細胞有絲分裂晚期迅速降解。由于其半衰期短，細胞脫離增殖周期后即刻降解，不容易受到其他因素的影響，因此，在評價腫瘤細胞的惡性程度、增殖活性及預后判斷方面均具有無可替代的優勢[12]。Yamashita等[13]對各種級別的膠質瘤進行Ki-67免疫組化研究，結果顯示低級別膠質瘤和高級別膠質瘤之間表達存在差異。Qu等[14]的研究發現，32例低級別膠質瘤和24例高級別膠質瘤Ki-67的陽性表達差異有統計學意義。本研究中，各級別膠質瘤細胞核中均可觀察到Ki-67陽性表達，低級別膠質瘤Ki-67陽性細胞散在分布，染色較淺；高級別膠質瘤陽性細胞彌漫分布，染色較深，低、高級別膠質瘤Ki-67LI為差異有統計學意義，并且Ki-67LI與膠質瘤病理級別呈顯著正相關，說明高級別膠質瘤較低級別膠質瘤增殖活性更強，Ki-67可以反映膠質瘤的惡性程度，與文獻報道一致。Shimizu等[15]研究發現膠質瘤的Ki-67LI與Cho水平呈顯著正相關。Tamiya等[16]研究了23例膠質瘤患者的波譜，發現腫瘤組織較正常腦組織Cho/Cr比值明顯升高,Cho/Cr值與Ki-67LI呈正相關。本研究結果亦顯示，膠質瘤Ki-67LI與Cho/Cr值呈顯著正相關，Ki-67是反映腫瘤細胞增殖活性的核抗原，Ki-67越高，表明膠質瘤的惡性程度越高，預后越差，由此可見Cho水平有助于術前初步評估膠質瘤的增殖活性及預后。本研究的不足之處在于，病理標本的取材與波譜測量ROI的選擇未能達到精確的一一對應關系，因此所得結果可能出現一定偏差，所有這些問題的解決有待進一步的研究。

綜上所述，多體素1H-MRS膽堿相對值能有效反映膠質瘤的增殖活性，可作為術前無創評價膠質瘤生物學行為的可靠影像學指標，可為膠質瘤的臨床診斷、治療及預后的判斷提供更多有價值的信息。

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Correlation between Cho/Cr ratio and expression of Ki-67 in brain glioma

HU Li-juan,LIAO Kai-bing
(Department of Radiology,Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wuhan 430015,China)

Objective:To study the 3.0T multivoxel proton magnetic spectroscopy(1H-MRS)findings in brain glioma and to investigate the correlation between Cho/Cr ratio and expression of Ki-67.Methods:Fifty-seven patients of brain gliomas were studied,including 28 cases of low-grade group(gradeⅠ～Ⅱ),29 cases of high-grade group(gradeⅢ～Ⅳ).All of them underwent 3.0T1H-MRS examination before operation.The Cho/Cr ratios were detected.We analyzed the correlation between Cho/Cr ratio and pathological grade of gliomas.Ki-67 immunohistochemical staining and Ki-67 labeling index(Ki-67LI)were measured after operation.We also analyzed the correlation between Ki-67LI and the pathological grade,the Cho/Cr ratio of gliomas.Results:①Significant differences were found in the ratios of Cho/Cr between low grade gliomas and high grade gliomas(P<0.001).The ratio of Cho/Cr was positively correlated with the tumor grade(r=0.616,P<0.001).The area under the curve(AUC)of Cho/Cr was 0.856.The threshold value of Cho/Cr ratio for differential diagnosis high grade and low grade brain gliomas was 2.44,the sensitivity was 79.3%,the specificity was 82.1%.②Ki-67LI of low grade glioma was (3.41±2.35)%,Ki-67LI of high grade glioma was(19.78±11.45)%,the difference was statistically significant(Z=-0.617,P<0.001).The Ki-67LI was positively correlated with the tumor grade and the Cho/Cr ratio(r=0.804,P<0.001).Conclusion:The Cho/Cr ratios of gliomas are correlated with the expression of Ki-67.It may be a useful image index,which can evaluate the proliferation activity and malignancy degree of glioma,without invasion.And it may be helpful in the clinical treatment and prognosis assessment.

Glioma;Ki-67 antigen;Magnetic resonance imaging

R739.4；R730.264；R445.2

A

1008－1062（2017）03－0153－04

2016－05－09；

2016－08－01

胡麗娟（1981-），女，湖北鄂州人，主治醫師。 E-mail：aloe_hlj@126.com

胡麗娟，湖北省中西醫結合醫院放射科，430015。E-mail：aloe_hlj@126.com