肉食品中β2—受體激動劑殘留的常用篩選和確證方法

涂毅　陳敏　孫炎木

【摘 要】本文首先介紹了β2-受體激動劑的藥理作用和對食品安全的影響，然后介紹了以酶聯免疫吸附法為代表的常用篩選方法，和以氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用為代表的確證方法，最后對肉食品中β2-受體激動劑的檢測進行了展望。

【關鍵詞】β2-受體激動劑；酶聯免疫吸附法；氣相色譜-質譜聯用；液相色譜-質譜聯用

1.引言

β2 -受體激動劑是一類能選擇性與β腎上腺素受體結合，產生受體激動樣作用藥物的總稱，是一系列以苯乙醇胺為母核，芳環和末端氨基多取代的衍生物（圖1），藥理作用主要為松弛支氣管平滑肌、提高骨骼肌收縮力、增加肺通氣量、增強支氣管纖毛運動[1]，常用來治療哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸系統疾病。近年研究發現，β2-受體激動劑能通過腎上腺受體刺激腺苷酸環化酶的合成，從而升高環磷酸腺苷（cAMP）的濃度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它還可降低血液中鎂離子濃度，間接促進肌肉興奮，抑制蛋白質分解和脂肪合成，進而增加肌肉蛋白合成[2]。在禽畜飼養中添加β2-受體激動劑能夠使動物生長速度加快，瘦肉相對增加。一般來說，飼料中添加適量，可使飼料轉化率、生長速率和酮體瘦肉率提高超過10%，所以也稱它為瘦肉精。然而，β2-受體激動劑的化學性質極穩定，日常烹飪過程如煮沸、燒烤和微波加熱均不能使其分解。長期食用高劑量β2-受體激動劑殘留的肉食品，會引起血壓升高，血液中鉀離子濃度降低，提高內臟平滑肌和橫紋肌興奮性，造成頭疼、肌肉酸痛、上吐下瀉等癥狀，對食用者的健康埋下隱患。鑒于其對食品安全的嚴重威脅，目前多數國家已經禁止在畜牧養殖中使用β2-受體激動劑作為獸藥飼料添加劑。我國農業部也多次發布公告禁止將克侖特羅、沙丁胺醇等β2-受體激動劑及鹽、酯等結合物用于所有食用動物中[3，4]。然而β2-受體激動劑的非法使用現象仍然嚴重。如2007年9月，上海市336人因食用了殘留有克侖特羅的豬肉發生集體中毒事件。北京奧運會前夕，當時中國男子游泳隊里最優秀也是最有望奪得獎牌的選手歐陽鯤鵬就是因為回家休假時與朋友吃了含有瘦肉精的烤串導致尿檢呈陽性，進而被終身禁賽。

2.β2-受體激動劑殘留的常用篩選方法

β2-受體激動劑的衍生物較多（表1），而且通常殘留量較低，因此對其檢測的方法提出了較高的挑戰。最初，很多國家采用放射免疫分析法和酶聯免疫分析法作為β2-受體激動劑的控制方法[5，6]，很快，免疫分析法因其高選擇性和快速性得到了越來越多的應用，其中酶聯免疫吸附法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）成為實驗室應用最廣泛的篩選方法。該方法利用抗原與抗體間的特異性反應，將待測物與中間酶連接，酶再催化底物產生有顏色的產物，通過酶標儀在特定波長下檢測產物的顏色來判斷待測物的含量。操作中一般用稀酸溶液提取，離心，調pH，用樣品稀釋液稀釋并在450nm波長處測定吸光值。檢測時注意提取液的pH，一般要求在6.5～7.5，在所有恒溫孵育過程中避免光線照射。目前，用酶聯免疫吸附法檢測肉制品中的β2-受體激動劑主要有克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。我國農業部在2008年的1025號公告中首次發布了動物性食品中多種β-受體激動劑殘留檢測的酶聯免疫吸附法國家標準[7]。

目前常用的酶聯免疫吸附法試劑盒品牌有“北京望爾”“美國柏爾”和“英國朗道”等，靈敏度可達ng/g（μg/kg）水平，可以滿足篩選分析的要求。陳穗等[8]使用克侖特羅試劑盒（德國r-Biopharm公司），從方法的檢出限、校正曲線的線性范圍、精密度、加標回收率測定等方面對酶聯免疫法檢測豬尿中克侖特羅殘留量的質量控制方法進行了探討。結果表明.該試劑盒的樣品檢測下限為0.03 μg/kg，定量下限為0.1 μg/kg。當克侖特羅標準添加水平為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg時，平均回收率分別約為84%和90%，均符合殘留分析質量控制要求。

經方法篩選結果為陽性的樣品，需要用確證方法確證。然而，由于不同生產廠家研發的試劑盒存在抗體提取及反應活性不穩定等因素，不同品牌甚至同一品牌不同批次之間都存在差異，因此免疫分析法始終不能成為法定的確證方法。

3.β2-受體激動劑殘留的常用確證方法

3.1 氣相色譜-質譜聯用

官方檢驗機構無論是篩查還是確證都傾向于選擇靈敏度高、特異性強、重復性好的質譜方法。20世紀80年代以前，氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）是日常檢驗唯一的選擇。該方法具有較高靈敏度和較強專屬性，同時由于β2-受體激動劑的化學結構中有不易氣化的羥基和氨基，因此需要對處理后的樣品進行衍生化。常用的衍生化試劑有N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MSTFA）和N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）。此外，由于其具有良好重現性，也更易于實現標準化。Clare等[9]在1979年將GC-MS應用于特布他林檢驗中。朱堅等[10]在2005年使用GC-MS同時測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留的方法進行研究。樣品經pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液提取，提取液經β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶水解，用高氯酸沉淀蛋白質，經異丙醇-乙酸乙酯（6：4，體積比）液-液分配，再經陽離子交換樹酯（SCX）小柱凈化后，用N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺衍生化。用美托洛爾為內標，同時測定11種β-受體激動劑。對肝、腎和肉樣品進行添加回收實驗，平均回收率為71%～94%，變異系數為4.6%～18.7%，最低檢測限為0.002～0.000 5mg/kg。

3.2 液相色譜-質譜聯用

與氣相色譜相比，液相色譜在β2-受體激動劑分離方面更有優勢，不需要衍生化，色譜系統使用的溶劑相容性也更好。但單獨使用液相色譜的效果并不理想，因為紫外檢測器的基質影響較大，限制了方法的靈敏度和專屬性，目前已較少作為確證分析方法。目前常用的是液相色譜-質譜聯用（LC-MS），該方法多次被應用于尿液、血漿、肝臟以及動物雞肉等樣品中β-受體激動劑的檢測。

LC-MS首次用于β2-受體激動劑的生物分析是在1989年，Blanchnower和Kennedy[11]應用該方法檢測牛尿中的克倫特羅殘留量。Kootstra等[12]在2004年利用LC-MS在牛肉中檢測出西馬特羅等8種β2-受體激動劑，且經過驗證該方法適用基質還包括兔肉、鴨肉、火雞肉以及各種各樣的魚肉。隨著離子阱-飛行時間串聯質譜儀的誕生，LC-MS的應用范圍更被進一步擴大，檢測數量和靈敏度亦是逐步提高。Sai等[13]在2012年應用高效液相色譜-線性離子阱質譜（HPLC-LIT-MS）法在豬肉、雞肉、肝臟等動物源食品中檢測出25種β2-受體激動劑和23種β2-受體激動劑，結果所有藥物的回收率均在46.6～118.9%之間，相對偏差在1.9～28.2%之間；方法的檢出限在0.05～0.49μg/kg之間，可以滿足同時檢測復雜基質中多種藥物殘留的要求。劉佳等[14]在2014年建立了一種豬肝中26種β2-受體激動劑藥物殘留的反相液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）檢測方法。樣品經β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解12 h 后，加入 HClO4調至 pH 1，去除蛋白，殘渣經過0.1 mol/L HClO4再次提取后合并提取液，調節混合提取液至pH 4，過混合陽離子（MCX）固相萃取柱凈化。采用0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，質譜（ESI+）采用多離子檢測模式對β2-受體激動劑的定量離子和定性離子進行監測，本方法在15 min內完成26種目標化合物的分離分析。26種β2-受體激動劑在5、10和20μg/L添加水平的回收率為64.0%～112.7%，相對標準偏差小于15.2%，方法檢出限為0.15～1.35μg/kg。

LC-MS法具有樣品用量少、靈敏度高、分離能力強、選擇性高以及定性、定量準確等優點，是目前確證β2-受體激動劑殘留的最佳首選方法。但LC-MS價格很貴，儀器結構非常復雜，檢測時間長，樣品前處理復雜，易受污染，因而只作為實驗室的確證方法。

我國在2008年發布了用LC-MS測定動物源性食品中多種β2-受體激動劑殘留量的國家標準[15]，對克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、馬布特羅等9種β2-受體激動劑在豬肉、豬肝、雞蛋和牛奶中的檢出限均達到0.25μg/kg。

4.結論與展望

隨著檢測儀器的發展，越來越多的技術將會被應用于β2-受體激動劑的檢測。免疫分析方法不僅有較好的靈敏度，且具有高通量、操作簡單、檢測成本低，能夠較好滿足基層實驗室、現場監控檢測、臨時快速抽樣檢測的要求，但是由于提供的分子結構信息較少，尚不能作為確證方法。色譜質譜技術作為主要的確證分析和精確定量方法，其應用日趨完善，并被采納為國家標準的儀器方法。此外，隨著冷凍過濾法、液相色譜分離法、加速溶劑萃取法、液液萃取法、固相微萃取法、固液萃取法、固相萃取法以及超臨界流體萃取等新型除脂凈化的報道與發展，樣品的分析步驟亦會得到進一步的簡化。

β2-受體激動劑殘留檢測技術的發展方向主要可概括為：（1）更高的靈敏度、更低的檢出限和定量限；（2）高通量，即單位時間內分析更多樣品；（3）更高的選擇性、特異性和抗干擾能力；（4）分析儀器更高的穩定性，更多聯用技術的發展；（5）減少污染和消耗，降低分析成本。由此可見，β2-受體激動劑的分析技術仍有待進一步改進和完善.需建立更有效和實用的檢測體系.從而更好地保證食品安全。

參考文獻：

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[15]農業部1025號公告-18-2008.中華人民共和國國家標準.動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法.GB/T 22286-2008.

基金項目：

湖北省普通高等學校“戰略性新興（支柱）產業人才培養計劃本科”資助項目[湖北省教育廳鄂教高[2013]11號]，省教育廳、省財政廳“生物技術專業綜合改革”試點資助項目[鄂教高辦[2014]6號]，湖北省教育科學“十二五”規劃2014年度課題“普通民辦高校創新人才培養模式研究”資助項目（201413272）。

作者簡介：

涂毅，男，講師，研究方向為生物化學、藥物檢測。

陳敏，女，現從事藥物殘留檢測方向的研究。

孫炎木，女，現從事藥物殘留檢測方向的研究。