光譜法結合分子對接模擬技術研究頭孢他啶與胰蛋白酶的相互作用機理

王金菊，劉保生，邊 剛，段韶彤，李彤彤

光譜法結合分子對接模擬技術研究頭孢他啶與胰蛋白酶的相互作用機理

王金菊，劉保生*，邊 剛，段韶彤，李彤彤

(河北大學化學與環境科學學院 河北省分析科學技術重點實驗室,河北 保定 071002)

本文主要通過熒光光譜法與分子對接技術研究了在298，303，310 K溫度下頭孢他啶(CFD)與胰蛋白酶(TRP)之間的作用機制。研究結果表明，CFD與TRP之間是通過1：1的靜態猝滅方式相互作用。依照雙對數方程處理熒光猝滅數據得到了CFD與TRP作用的結合常數Ka和結合位點數n。通過熱力學方程求得了不同溫度下CFD與TRP作用的熱力學參數。實驗數據表明，它們之間的作用力主要是疏水作用和氫鍵作用，這與分子對接技術所得的結果是一致的。

光譜法； 分子對接； 頭孢他啶； 牛胰蛋白酶； 作用機理

1 引 言

頭孢他啶(Ceftazidime，CFD)為第三代頭孢菌素類抗生素，該藥物通過抑制細菌細胞壁合成產生抗菌活性，對革蘭陰性菌產生的β-內酰胺酶具有高度的穩定性，與第一、二代頭孢菌素相比，抗菌活力較強，抗菌譜較廣[1]。頭孢他啶適用于敏感菌引起的下列感染:呼吸道感染、尿路感染、腹內感染、嚴重耳鼻喉感染、皮膚軟組織感染、敗血癥、骨和關節感染等，也可用于手術預防感染[2]。胰蛋白酶(Trypsin，TRP)是由胰腺分泌的一種蛋白水解酶，它是自然界中發現的最為豐富的蛋白酶，在食物蛋白和其他生理過程的消化與分解過程中起著十分重要的作用，主要包括止血、細胞凋亡、信號轉導、生殖和免疫反應等[3]。TRP的分子量大約為23 300，由223個氨基酸殘基所組成[4]，4個色氨酸、10個酪氨酸和6個苯丙氨酸是其固有熒光基團[5]。在立體結構中，它是由兩個大小相似的結構域組成，二硫鍵連接著兩個結構域，每個結構領域都是由6條反向平行的β-折疊組成[4,6]。在兩個域之間,氨基酸His57、Asp102和Ser195為TRP的催化活性中心位點，形成了一種催化三聯體[7-8]。TRP作為人體消化系統的一種重要的蛋白酶，由于其重要的生理功能，經常被選擇作為目標蛋白[9]來研究藥物小分子對其結構的影響，在生物、醫學、化學等領域均具有重要的意義。

目前，TRP與各類藥物及其化合物相互作用已有相關文章報道[10-11]，但是對于CFD與TRP之間相互作用的研究卻未見報道，本文利用熒光光譜法與分子對接模擬技術研究了不同溫度條件下CFD與TRP之間的反應機理，利用CFD對TRP的熒光猝滅計算出結合常數以及結合位點數，進而算出它們之間的熱力學參數。以藥物為研究靶向來探討它與蛋白的結合狀況，有助于全方位地了解藥物與蛋白之間的作用機理，更有助于醫學研究者設計出作用性強、副作用小的藥物。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

試劑：胰蛋白酶(TRP，純度≥ 99 %，Sigma公司)，配成濃度為1.0×10-4mol/L的儲備液；頭孢他啶(CFD,標準品，純度≥ 98.5%)，配成1.0×10-3mol/L的儲備液，用時逐級稀釋；配制pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液(內含0.15 mol/L NaCl，用以調節生理條件下的離子強度)。實驗用水均為二次石英蒸餾水，以上儲備液均在冰箱中4 ℃下避光保存。

儀器：RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津)；UV-3600紫外可見分光光度計(日本島津)；MOS-450/SFM300圓二色譜儀(法國Bio-logic)；SYC-15B超級恒溫水浴(南京桑力電子設備廠)；CS501超級恒溫水浴(南通科學儀器廠)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器。

實驗中所測的熒光強度均采用“內濾光效應”公式(1)[12]進行校正：

Fcor=Fobse(Aex+Aem)/2，

(1)

式中Fcor和Fobs分別代表校正后和測得的熒光強度，Aex和Aem分別是所測藥物在激發和發射波長處的吸光度。圖1為頭孢他啶的結構式。

圖1 頭孢他啶結構式Fig.1 Chemical structure of CFD

2.2 實驗方法

2.2.1 紫外吸收光譜法

將0.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液和1.0 mL的1.0×10-5mol/L的TRP溶液加入到10 mL的比色管中，并加入不同體積的CFD溶液，用二次蒸餾水定容至5 mL后搖勻。在恒溫水浴靜置30 min后，用相應濃度的CFD溶液作為空白參比，測定溶液的紫外吸光度，并繪制CFD-TRP體系的紫外吸光譜圖。

2.2.2 熒光猝滅法

在298，303，310 K下，于一系列10 mL比色管中依次加入1.0 mL pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL 1.0×10-5mol/L的TRP溶液及不同體積的CFD溶液，用二次蒸餾水定容至5 mL，搖勻，在恒溫水浴中放置30 min，使反應完全。將配好的溶液置于1 cm石英比色皿中，設定狹縫寬度為5 nm，固定激發波長λex=280 nm或295 nm，分別掃描熒光光譜，記錄各溶液的熒光強度F。

2.2.3 同步熒光法

按以上同樣方法操作，固定發射波長與激發波長的差Δλ分別為15 nm、60 nm掃描體系的同步熒光光譜并記錄同步熒光強度F。

2.2.4 圓二色譜法

在298 K溫度下，將1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L的TRP溶液和不同濃度的CFD溶液依次加入到10 mL比色管中，用二次蒸餾水定容至5 mL，搖勻，在恒溫水浴靜置20 min。使用1 mm的石英吸收池，掃描速度設置為1 nm·s-1，記錄190～270 nm波長范圍內CFD作用于TRP前后的圓二色譜譜圖。

2.2.5 分子對接

TRP的晶體結構(PDB ID:2ZQ1)來自蛋白數據庫(Protein data bank)，CFD的結構式在ChemDraw Pro 14.0 軟件中繪制，同時在ChemBio 3D Ultra 14.0 軟件中對其三維結構進行能量最優化。最后使用 AutoDock 4.2.6 軟件對CFD和TRP進行分子對接，應用拉馬克(LGA)遺傳算法來計算與蛋白質結合的藥物分子的可能構象[13]。

3 結果與討論

3.1 TRP與CFD體系的紫外光譜

按2.2.1操作，體系的紫外光譜圖如圖2所示。圖中在208 nm有一個強吸收峰且在280 nm左右有一個較弱的吸收峰。隨著藥物CFD濃度的不斷增大，CFD-TRP體系的紫外光譜在208 nm處的吸收峰強度降低并發生紅移，280 nm處吸收峰強度增加且發生藍移。這說明CFD的加入改變了TRP的構象，TRP與藥物CFD間形成了新的復合物，CFD-TRP體系的猝滅方式為靜態猝滅[14]。

CTRP=2.0×10-5mol/L,1～6:CCFD=(0,5.0,6.0,8.0,10.0,30.0)×10-5mol/L
圖2 CFD-TRP體系的紫外光譜(T=298 K)
Fig.2 Absorption spectra of CFD-TRP system(T=298 K)

3.2 TRP與CFD體系的熒光光譜

按2.2.2操作，考察濃度不同的CFD對TRP熒光光譜的影響，結果如圖3所示(λex=295 nm時的熒光猝滅譜圖與其類似)。由圖3可知，隨著CFD濃度的增大，TRP在340 nm處的熒光強度逐漸降低，表明CFD與TRP之間存在相互作用。為更深入地研究猝滅機理，將猝滅數據按Stern-Volmer方程[15]處理：

I0/I=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]，

(2)

式中，I0為CFD不存時體系的熒光強度，I為CFD存在時體系的熒光強度，τ0為分子熒光平均壽命(約10-8s)，Ksv為Stern-Volmer猝滅常數，[L]為猝滅劑的濃度，Kq為猝滅速率常數。依據公式(2)可得TRP與藥物的猝滅常數Ksv以及猝滅速率常數Kq，列于表1。由表1可知，隨溫度的升高，Ksv依次減小，由此可推斷TRP-CFD體系的結合過程主要是靜態猝滅過程[16]。對于該類猝滅過程，用方程(3)[17]來計算結合常數Ka和結合位點數n：

(3)

其中，[Dt] 為CFD的總濃度，Ka表示結合常數；[Bt]為蛋白質的總濃度，n為結合位點數。以lg(I0/I-1)對lg{[Dt]-n[Bt](1-I/I0)}進行作圖,根據標準曲線的截距和斜率可得到體系的Ka及n，最終結果見表1。由表1可知，CFD與TRP兩者的結合位點數n約為1，該體系的Ka值在λex=280 nm和295 nm時均隨溫度的升高而減小，表明CFD與TRP形成復合物的穩定性隨溫度升高而降低，更進一步說明CFD對TRP的猝滅方式為靜態猝滅[18]。

CTRP=2.0×10-6mol/L,1～10:CCFD= (0,0.2,0.4,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,10.0)×10-5mol/L

圖3 CFD-TRP的熒光發射光譜 (T=298 K,λex=280 nm)
Fig.3 Fluorescence emission spectra of TRP-CFD (T=298 K,λex=280 nm)

表1 不同溫度下CFD-TRP體系的猝滅反應參數Tab.1 Quenching reactive parameters of CFD-TRP system at different temperatures

r1為方程I0/I-[L]的線性相關系數；r2為方程lg[(I0-I) /I]-lg{[Dt]-n[Bt] (I0-I)/I0}的線性相關系數。

3.3 TRP與CFD體系的同步熒光光譜

同步熒光光譜可以呈現出蛋白質熒光團的微環境信息，能夠簡單有效地測量熒光猝滅和最大發射波長可能發生的變化[19]。Δλ=60 nm僅反映TRP中色氨酸殘基(Trp)的光譜信息，即包含殘基的熒光強度和極性大小的改變，而Δλ=15 nm反映的是TRP中酪氨酸殘基(Tyr)的光譜信息[20]。圖4為CFD-TRP體系的同步熒光光譜。由圖4可知，Δλ=15 nm時，隨CFD濃度的增大，TRP的熒光強度逐漸降低，Tyr殘基最大發射峰的位置從306 nm紅移到307 nm。當Δλ=60 nm時，Trp殘基最大發射峰的位置從344 nm紅移到348 nm。該現象說明有少量的Tyr殘基參與該反應，但參與該反應的主要是Trp殘基。峰位置的改變說明CED與TRP的相互作用改變了Trp和Tyr所在的微環境[21]。由于Trp和Tyr微環境的改變使得TRP腔內疏水環境的極性增強，疏水性減弱，導致肽鏈變得松散，最終導致TRP的構象發生了變化。

CTRP=2.0×10-6mol/L,1～10:CCFD= (0,0.2,0.4,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,10.0)×10-5mol/L

圖4 CFD-TRP體系的同步熒光光譜(T=298 K)。 (a) Δλ=15 nm;(b) Δλ=60 nm。
Fig.4 Fluorescence spectra of TRP-CFD system(T=298 K).(a) Δλ=15 nm.(b) Δλ=60 nm.

3.4 TRP與CFD體系的作用力類型

CFD和TRP結合反應的作用力類型可以根據CFD與TRP相互作用的熱力學參數進行推斷。ΔGO、ΔSO、ΔHO等熱力學參數由以下公式[22]得出：

RlnK=ΔSO-ΔHO/T，

(4)

ΔGO=ΔHO-TΔSO，

(5)

由以上方法計算得到TRP-CFD體系的熱力學參數，見表2。由表2可知，ΔGO<0，ΔSO>0，說明CFD對TRP的猝滅反應是自發進行；ΔHO< 0，ΔSO> 0，表明CFD與TRP間以靜電引力方式相互結合形成CFD-TRP復合物[23]。

表2 不同溫度下CFD-TRP體系的熱力學參數Tab.2 Thermodynamic parameters of CFD-TRP system at different temperatures

3.6 TRP與CFD體系的結合距離

根據F?rster非輻射能量轉移理論[24]，能量供體TRP與能量受體CFD間距離r與能量轉移效率為50%時所對應的臨界能量轉移距離R0及能量轉移效率E之間有如下關系[25]：

(6)

(7)

(8)

式中，F0為TRP的熒光強度；F為TRP和CFD濃度相等時的熒光強度；K2為取向因子，取TRP與CFD各向隨機分布的平均值2/3；Φ為當CFD不存在時TRP的熒光量子產率，取TRP中Trp的量子產率0.118[26]；N為溶劑的折射率，取水和有機物的平均值1.336；J為TRP的熒光發射光譜與CFD的紫外吸收光譜之間的重疊積分(圖5中陰影部分)；F(λ)為TRP在波長λ處的熒光強度；ε(λ)為CFD在波長λ處的摩爾吸光系數。通過圖5 TRP的熒光發射光譜(λex=280 nm)(1)和CFD的紫外吸收光譜(2)(T=298 K)
Fig.5 Overlap of the fluorescence spectrum of TRP(λex=280 nm) (1) and the absorption spectrum of CFD (2) (T=298 K).CCFD=2CTRP=2.0×10-6mol/L.公式計算依次得到E值、J值、R0值和r值(表3)。從表3可以看出：r<7 nm，說明CFD與TRP間存在非輻射能量轉移[27]。此外，隨著溫度的不斷升高，能量轉移效率逐漸降低，TRP和CFD之間的距離增大，導致CFD-TRP體系的結合穩定性降低，Ka值減小。

3.7 TRP與CFD體系的圓二色譜

圓二色譜法(CD)被廣泛用來測定蛋白質的二級結構。CFD-TRP體系的CD譜圖如圖6所示。由圖6可知，在208 nm處有一個負的吸收峰，且該負峰是TRP中α-螺旋結構的特征峰[28]。隨著溶液中CFD濃度的不斷增加，吸收峰的強度逐漸降低，表明CFD引起了TRP的二級結構發生了變化。為了進一步說明TRP中的α-螺旋含量的變化，利用以下計算公式[29]，得到具體的含量變化：

(9)

式中NMRE為在200 nm處的摩爾橢圓率；數字4 000為在200 nm處β-折疊和無規卷曲的NMRE值；數字33 000為在200 nm處純粹的α-螺旋的NMRE值。

(10)

式中，n為TRP中氨基酸總數，l為樣品池的光徑 (cm)，Cp為TRP的濃度,ICD為CD峰強度。

由計算結果可知，CFD的TRP的α-螺旋結構從10.95%降到3.22%，進一步說明隨著CFD濃度的增大，負峰的強度逐漸降低但峰的位置和峰形沒有明顯變化，表明在CFD作用下導致TRP中的α-螺旋結構變得有些松散且蛋白的二級結構也隨之發生改變，從而使得TRP熒光被猝滅，但是α-螺旋結構仍占有主導地位[30]。

CTRP=2.0×10-5 mol/L,CCFD= (0.8,1.6)×10-4 mol/L

3.8 分子對接

分子模擬技術普遍地應用于分析蛋白與配體之間的相互作用。分子對接的目的主要是尋找底物分子和受體分子間的最佳結合位置[31]。通過分子對接軟件，我們選取了TRP與藥物CFD最佳的結合位置。由對接結果數據處理可知，CFD與TRP的結合能為-23.75 kJ/mol。這一結果與實驗所得的熱力學參數非常接近(ΔGO=-23.64 kJ/mol)，從而更進一步證明了CFD與TRP的相互作用。

圖7所示為CFD與TRP的分子對接最佳構象圖，并且截取了CFD藥物分子周圍的氨基酸殘基。CFD分子被氨基酸殘基Phe41、His57、Ser195、Gly193、Gln192、Cys191、Gly219、Cys220、Trp215和Asp189所包圍，其中多數氨基酸殘基為疏水性氨基酸殘基。這一結果表明，CFD與TRP之間存在疏水作用，其作用力主要以靜電引力為主[32]，并且CFD能有效地猝滅TRP的內源熒光,這與熒光光譜實驗結果是一致的。

從圖7中更清楚地發現CFD與Lly193、Ser195、Asp189和Gly219形成氫鍵，鍵長分別為0.211 2，0.183 3，0.178 6，0.196 6 nm。這一結果表明，CFD與TRP之間存在較強的氫鍵作用力。因此，分子對接的研究結果說明CFD與TRP的結合模式主要是疏水作用，同時存在氫鍵作用，與實驗結果一致。

圖7 CFD與TRP相互作用的分子對接圖。 (a) CFD與TRP發生作用區域；(b) CFD與TRP活化中心發生作用的氨基酸殘基。Fig.7 Computation docking model of the interaction between CFD and TRP.(a) Binding site in the TRP cavity.(b) Detailed illustration of the amino acid residues lining the binding sitein the TRP cavity.

4 結 論

通過光譜法和分子對接模擬技術對CFD與TRP之間的反應機理進行詳細的研究。實驗結果表明，CFD對TRP有熒光猝滅作用，該猝滅過程是由于生成CFD-TRP復合物所引起的靜態猝滅過程，過程伴隨著非輻射能量轉移。CD譜圖顯示隨著藥物CFD的加入改變了TRP的微環境，TRP的二級結構發生了變化。隨之通過熱力學方程得到熱力學參數，所得數據結果與分子對接技術相符，進一步表明CFD與TRP的結合模式主要是靜電引力，同時也存在氫鍵以及疏水作用力。與此同時，所得到的實驗結論對于了解藥物藥效的實質具有很大的幫助，為藥物的研究發展提供了更具有意義的理論依據。

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王金菊(1990-),女，河北廊坊人，碩士研究生，2015年于滄州師范學院獲得學士學位，主要從事分子發光學理論與應用的研究。

E-mail: 778948454@qq.com

劉保生(1963-)，男，河北保定人，碩士，研究員，1992年于河北大學獲得碩士學位，主要從事分子發光學理論與應用的研究。

E-mail: lbs@hbu.edu.cn

Mechanism of Interaction Between Ceftazidime and Trypsin by Spectroscopic and Molecular Docking Methods

WANG Jin-ju,LIU Bao-sheng*,BIAN Gang,DUAN Shao-tong,LI Tong-tong

(KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The binding of ceftazidime (CFD) with trypsin (TRP) was investigated by spectroscopic and molecular docking methods under different temperature conditions (298,303 and 310 K).The results demonstrate that the interaction between CFD and TRP is taking placeviastatic quenching with 1：1 binding ratio.The fluorescence data were treated by using the double logarithmic equation,and the binding constantsKaof the interaction of CFD-TRP systems and the number of binding sitesnwere obtained.The thermodynamic parameters of CFD-TRP systems under different temperatures were obtained by the thermodynamic equation.The experimental data show that the interactions between them are mainly hydrophobic interaction and hydrogen bonding interaction,which is consistent with the molecular docking results.

spectrometry; molecular docking; ceftazidime; trypsin; interaction mechanism

1000-7032(2017)09-1256-08

2017-02-12；

2017-04-05

國家自然科學基金(21375032)； 河北省重點基礎研究項目(10967126D)資助

O657.3

A

10.3788/fgxb20173809.1256

*CorrespondingAuthor,E-mail:lbs@hbu.edu.cn

Supported by National Natural Science Foundation of China(21375032); Key Basic Research Project of Hebei Province (10967126D)