養(yǎng)陰安神顆粒提取工藝優(yōu)選

袁柳萍 羅霄山 孫冬梅 吳小斌 王洛臨

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405； 2 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州，510095)

中藥研究

養(yǎng)陰安神顆粒提取工藝優(yōu)選

袁柳萍1，2羅霄山2孫冬梅2吳小斌1，2王洛臨2

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405； 2 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州，510095)

目的：優(yōu)選養(yǎng)陰安神顆粒的提取工藝條件。方法：通過觀察養(yǎng)陰安神方對戊巴比妥鈉催眠小鼠睡眠時間的影響，對該處方提取工藝進行了初步篩選；根據(jù)藥效觀察結(jié)果，以君藥酸棗仁中斯皮諾素的提取率和固形物得率為評價指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計法，篩選出最優(yōu)的水提工藝條件，并采用正交試驗設(shè)計法，以斯皮諾素的保留率及固形物除雜率為評價指標(biāo)，篩選出最佳醇沉工藝條件。結(jié)果：提取工藝路線采用全方水提醇沉的方法。水提最佳工藝為：提取3次，1 h/次，加8倍量水，醇沉最佳工藝為：水提液濃縮至相對密度1.25(60 ℃)，放冷加入適量乙醇至乙醇含量為80%，4 ℃冰箱中靜置36 h。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行，為養(yǎng)陰安神顆粒后期的成型工藝奠定了基礎(chǔ)。

養(yǎng)陰安神顆粒；提取工藝；正交試驗

養(yǎng)陰安神方是臨床醫(yī)師治療失眠的經(jīng)驗方，由酸棗仁、麥冬、梔子、白芍、合歡花等組成，具有清心疏肝，滋陰安神的功效，用于治療陰虛火旺所致失眠。現(xiàn)代藥化及藥理研究表明，酸棗仁的主要活性成分是黃酮類和皂苷類，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗焦慮、抗抑郁等藥理作用[1-2]；麥冬主要化學(xué)成分是多糖、皂苷、黃酮等，藥理研究表明麥冬水提物具有明顯鎮(zhèn)靜作用[3]，其皂苷有抗炎、抗氧化、增強免疫作用[4]。本試驗根據(jù)處方中各味中藥不同活性成分的性質(zhì)，確定合理的提取工藝條件，以保證制劑質(zhì)量和療效，考察該處方不同提取工藝樣品對戊巴比妥鈉催眠小鼠睡眠時間的影響[5-7]，初步篩選提取工藝路線，根據(jù)藥效篩選結(jié)果，進一步優(yōu)選提取工藝條件[8-11]，為該制劑的成型工藝奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物 酸棗仁為鼠李科植物酸棗仁(ZiziphusjujubeMill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou)的干燥成熟種子，麥冬為百合科植物麥冬(Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker Cawl.)的干燥塊根，梔子為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEillis)的干燥成熟果實，白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，合歡花為豆科植物合歡(AlbiziajulibrissinDurazz.)的干燥花序或花蕾，均購自廣州中芝源藥業(yè)有限公司。經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院中藥分析研究室畢曉黎主任鑒定均符合2015年版中國藥典一部相關(guān)藥材項下規(guī)定。斯皮諾素對照品(批號：111869-201203，中國食品藥品檢定研究院)；地西泮片(批號：130306，山東省平原制藥廠)：主要用于焦慮，鎮(zhèn)靜催眠。百樂眠膠囊(批號：14111812，揚子江藥業(yè)集團有限公司)：滋陰清熱，養(yǎng)心安神。用于肝郁陰虛型失眠癥，癥見入睡困難，多夢易醒，醒后不眠，頭暈乏力，煩躁易怒，心悸不安等。戊巴比妥鈉(批號：120505，廣州有田生物科技有限公司)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 動物 SPF級KM小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號No.44007200020431。動物實驗環(huán)境：廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)SPF級動物實驗室，設(shè)施使用許可證號SYXK(粵)2015-0059。

1.3 試劑與儀器 1200系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；JJ300型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；KA2500DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)。

1.4 不同提取工藝樣品的制備 工藝一組(水提醇沉組)：全方水提，加10倍量水，提取2次，2 h/次，濾過，合并濾液，將濾液濃縮至相對密度1.08～1.12(50 ℃)，加乙醇至含醇量達60%，冷藏24 h，120目濾過，60 ℃減壓濃縮至相對密度1.20～1.25(60 ℃)，60～75 ℃減壓干燥，取干浸膏粉碎成細粉，作為樣品1，每克細粉含生藥4.06 g，備用。

工藝二組(全方水提組)：全方水提，加10倍量水，煎煮2次，2 h/次，濾過，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至相對密度1.20～1.25(60 ℃)，60～75 ℃減壓干燥，取干浸膏粉碎成細粉，作為樣品2，每克細粉含生藥2.722 g，備用。工藝3組(部分醇提部分水提組)：取酸棗仁、白芍、合歡花。加12倍量70%乙醇，提取2 h，濾過，濾液減壓回收乙醇，取濃縮液備用；取濃縮液備用，藥渣與梔子、麥冬合并，加12倍水煎煮2次，2 h/次，濾過，合并濾液與醇提取濃縮液，濃縮至相對密度1.20～1.25(60 ℃)，60～75 ℃減壓干燥，取干浸膏粉碎成細粉，作為樣品3，每克細粉含生藥2.716 g，備用。

2 結(jié)果

2.1 觀察不同樣品對戊巴比妥鈉催眠小鼠睡眠時間的影響 取SPF級KM小鼠90只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機分為9組，分別為對照組、地西泮片組、百樂眠膠囊組、養(yǎng)心安神方工藝一高、低劑量組、養(yǎng)陰安神方工藝二高、低劑量組、養(yǎng)陰安神方工藝三高、低劑量組，每組10只。各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積20 mL/kg，對照組給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。各組末次給藥后1 h，腹腔注射65 mg/kg戊巴比妥鈉溶液，記錄從開始注射戊巴比妥鈉到小鼠翻正反射消失的時間為入睡潛伏期(min)，從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時間為睡眠時間(min)。結(jié)果見表1。

表1 養(yǎng)陰神安方不同提取工藝對戊巴比妥鈉催眠小鼠睡眠時間的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

表1表明，與對照組比較，陽性對照藥物地西泮、百樂眠膠囊組小鼠入睡潛伏期無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，睡眠時間顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與對照組比較，養(yǎng)陰安神方工藝一、養(yǎng)陰安神方工藝二、養(yǎng)陰安神方工藝三高劑量組和低劑量組小鼠入睡潛伏期均無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，睡眠時間均顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。養(yǎng)陰安神方工藝一、養(yǎng)陰安神方工藝二、養(yǎng)陰安神方工藝三等劑量組相互比較，小鼠入睡潛伏期均無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，睡眠時間均無顯著影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由于臨床處方量較大，故在保證日服劑量的前提下，選擇工藝一。

2.2 水提工藝優(yōu)選 選取處方中君藥酸棗仁中的黃酮類成分斯皮諾素的提取率以及固形物得率為評價指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗法，考察加水倍量、提取時間及提取次數(shù)對水提工藝的影響。

2.2.1 樣品溶液的制備 按照處方比例稱取各味藥材共9份，按正交試驗設(shè)計因素水平表進行提取，濾過，濃縮至一定體積，備用。

2.2.2 固形物得率的測定 精密吸取樣品濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥5 h至恒重，置干燥器中冷卻至室溫，精密稱重，照干燥失重法(2015年版中華人民共和國藥典四部通則0831)測定，計算固形物得率。

2.3 HPLC測定提取液中斯皮諾素的含量

2.3.1 斯皮諾素色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(15∶85)，檢測波長為335 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為20 ℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取斯皮諾素對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含斯皮諾素0.203 6 mg的斯皮諾素對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密吸取樣品溶液1 mL，置5 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲30 min，冷卻，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 除去酸棗仁，按處方比例稱取其余各藥材，按2.3.3項下方法制備，即得陰性對照溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取斯皮諾素對照品溶液1、2、3、4、5、6 L，按2.3.1項下條件進樣，以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得斯皮諾素的回歸方程為：Y=3 166.982 1X-19.736 7，r=0.999 95，結(jié)果表明：在0.203 6～1.221 6 g范圍內(nèi)，斯皮諾素峰面積與含量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 專屬性試驗 吸取上述斯皮諾素對照品、供試品以及酸棗仁陰性對照溶液，按2.3.1項下條件進樣，結(jié)果顯示在供試品與對照品在相應(yīng)位置上有相同色譜峰，且陰性對照溶液在斯皮諾素相應(yīng)位置無吸收，表明處方中其他藥味對本測定無干擾，且分離度大于1.5，理論塔板數(shù)高于2 000。見圖1。

2.6 正交試驗設(shè)計 在前期單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇加水倍量、提取時間及提取次數(shù)為考察因素，以斯皮諾素提取率以及固形物得率的綜合評分為評價指標(biāo)，加權(quán)系數(shù)分別為0.6、0.4，進行L9(34)正交試驗，篩選最優(yōu)水提工藝條件，因素水平表見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

圖1 養(yǎng)陰安神顆粒HPLC色譜圖

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照

表2 因素水平表

表3 水提工藝正交試驗結(jié)果

綜合評分=(斯皮諾素提取率/斯皮諾素提取率最大值)×60+(固形物得率/固形物得率最大值)×40。

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99。

根據(jù)直觀分析法分析試驗結(jié)果，最佳工藝條件為A3B2C3；采用方差分析結(jié)果，因素C對實驗結(jié)果有顯著影響，A、B無顯著影響，影響程度由大至小分別為：C>B>A，因此確定最佳水提工藝為A1B1C3，即加8倍量水，提取3次，1 h/次。

2.7 驗證試驗 稱取處方量藥材按優(yōu)選的提取工藝進行試驗，平行操作3份。綜合評分值分別為90.29、99.97、90.96，平均綜合評分值為93.74，與正交試驗綜合評分最大值差異不大，表明優(yōu)選出的水提工藝條件穩(wěn)定合理可行。

2.8 醇沉工藝優(yōu)選

2.8.1 正交試驗設(shè)計 按最佳水提工藝提取適量藥液，濃縮至適當(dāng)密度，均分9份，進行醇沉正交試驗。選擇藥液密度、醇沉終濃度、醇沉?xí)r間作為考察因素，各取3水平，以斯皮諾素保留率以及固形物除雜率的綜合評分為考察指標(biāo)，加權(quán)系數(shù)分別為0.6，0.4。選擇L9(34)正交試驗，篩選最佳醇沉工藝條件，因素水平表見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 因素水平表

表6 醇沉工藝正交試驗結(jié)果

綜合評分=(斯皮諾素保留率/斯皮諾素保留率最大值)×60+(固形物除雜率/固形物除雜率最大值)×40。

表7 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99。

由直觀分析法分析試驗結(jié)果，最佳工藝條件為A3B3C3；根據(jù)方差分析結(jié)果，得出因素A、B、C對實驗結(jié)果均有顯著影響，影響因素由大至小分別為：A>B>C，因此確定最佳醇沉工藝A3B3C3，即藥液相對密度為1.25(60 ℃)，醇沉終濃度為80%，靜置時間為36 h。

2.8.2 驗證試驗 按最佳水提工藝條件提取藥材，將提取液濃縮至相對密度為1.25(60 ℃)，放置室溫，加適量乙醇，至含醇量達到80%，放置4 ℃冰箱中靜置36 h，濾過。平行操作三份，綜合評分值分別為85.36、84.69、88.51，平均綜合評分86.19，表明優(yōu)選出的醇沉工藝條件合理，穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。

3 討論

藥效試驗結(jié)果表明，養(yǎng)陰安神方3種提取工藝的提取物對戊巴比妥鈉催眠小鼠睡眠時間的延長均有明顯作用，且各種工藝提取物的高低劑量組均無顯著性差異。由于臨床處方量較大，為了保證臨床療效，減少日服用劑量，故選擇水提醇沉工藝。

對水提工藝以及醇沉工藝條件分別通過正交試驗法進行篩選，考察水提工藝選擇君藥中的斯皮諾素提取率和固形物得率的綜合評分為指標(biāo)。考察醇沉工藝時選擇固形物除雜率和君藥中斯皮諾素保留率的綜合評分為指標(biāo)，對于權(quán)重系數(shù)的設(shè)計，考慮到優(yōu)選保留有效成分的前提下，盡可能多除去雜質(zhì)，因此設(shè)置有效成分的提取率(保留率)權(quán)重系數(shù)0.6，固形物的得率(固形物除雜率)權(quán)重系數(shù)0.4。

處方中酸棗仁的主要成分是皂苷類和黃酮類，酸棗仁皂苷A屬于脂溶性成分，通常采用50%～70%乙醇超聲波提取[12-13]，在水提液中含量較低，所以不選作指標(biāo)成分。

本研究優(yōu)選的養(yǎng)陰安神顆粒提取工藝合理可行、重復(fù)性較好，為后期成型工藝奠定良好的基礎(chǔ)，也為該制劑的研究開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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(2016-10-26收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

第十四屆世界中醫(yī)藥大會暨“一帶一路”中醫(yī)藥文化周第二輪會議通知2017年10月*東南亞

各位專家、各位同仁：

由世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會主辦的世界中醫(yī)藥大會是全球中醫(yī)藥領(lǐng)域規(guī)模大、參與廣、層次高的學(xué)術(shù)盛會。至今已在中國、法國、加拿大、新加坡、中國澳門、澳大利亞、荷蘭、英國、馬來西亞、美國、俄羅斯、西班牙、新西蘭成功舉辦了十三屆。第十三屆世界中醫(yī)藥大會期間舉辦“一帶一路”中醫(yī)藥文化周系列活動，為中醫(yī)藥在大洋洲的發(fā)展搭建了廣闊的平臺。

“第十四屆世界中醫(yī)藥大會暨‘一帶一路’中醫(yī)藥文化周”，將于2017年10月下旬在東南亞舉行。活動期間，來自世界各地的中醫(yī)藥專家學(xué)者、政府官員、企業(yè)家將分享他們的理論研究和臨床經(jīng)驗、科研成果和新發(fā)明新創(chuàng)造，大會附設(shè)中醫(yī)藥服務(wù)貿(mào)易展覽會。活動期間將組織多種形式的學(xué)術(shù)考察調(diào)研活動。

現(xiàn)就有關(guān)事宜通知如下：

一、地點：泰國、柬埔寨、尼泊爾、越南

二、主題：助力一帶一路，服務(wù)民眾健康

三、會議安排：10月20-24日，第十四屆世界中醫(yī)藥大會，泰國·曼谷；

10月23-27日，“一帶一路”中醫(yī)藥文化周柬埔寨專場，吳哥；

10月24-27日，“一帶一路”中醫(yī)藥文化周尼泊爾專場，加德滿都；

10月26-29日，“一帶一路”中醫(yī)藥文化周越南專場，胡志明；

四、會議主要議題及征文內(nèi)容：

1.中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論研究；

2.中醫(yī)藥臨床實踐：臨床研究方法創(chuàng)新與進展、臨床療效評估體系研究、老中醫(yī)臨證經(jīng)驗總結(jié)、特色療法體會及推廣、中醫(yī)養(yǎng)生保健治未病研究等；

3.針灸推拿研究實踐：針?biāo)幣浜吓R床研究、特殊針法臨床經(jīng)驗介紹、中醫(yī)針灸治療在區(qū)域性疾病治療中的特色與優(yōu)勢等；

4.中藥研究：中藥方劑學(xué)、臨床配伍研究、中藥應(yīng)用及研究等；

5.中西醫(yī)結(jié)合研究：理論創(chuàng)新、最新進展、實踐創(chuàng)新、經(jīng)驗總結(jié)；

6.中醫(yī)手法流派的傳承與發(fā)展；

7.中醫(yī)藥國際標(biāo)準化、信息化研究；

8.中醫(yī)藥在世界各國的發(fā)展及立法情況，各國中醫(yī)教育動態(tài)、教育制度現(xiàn)狀及科研情況；

9.中醫(yī)藥文化與非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護；

10.道地藥材與瀕危珍稀動植物保護；

11.中醫(yī)藥服務(wù)貿(mào)易理論研究與實踐及經(jīng)驗交流。

五、參會人員：

相關(guān)國家政府官員，各國中醫(yī)藥、傳統(tǒng)醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合、現(xiàn)代醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域從事醫(yī)療、教育、科研、管理、生產(chǎn)、貿(mào)易的專家學(xué)者和企業(yè)家，世界中聯(lián)各國各地區(qū)會員。

六、會議安排：

1.學(xué)術(shù)會議：開、閉幕式，主題演講，分會場專題報告，現(xiàn)場演示工作坊，歡迎晚宴。

2.中醫(yī)藥服務(wù)貿(mào)易展覽會：每個展位3*3 m，1張桌子，2把座椅，1個插座，基本照明，免2人參會注冊費。

3.參會者可授予中國國家級繼續(xù)教育二類學(xué)分證書6分，如有需要，請?zhí)崆案嬷髸M委會。

4.“一帶一路”中醫(yī)藥國際交流考察：具體安排請咨詢世界中聯(lián)國際聯(lián)絡(luò)部。

七、重要日期：

2017年7月1日大會注冊費優(yōu)惠截止。

2017年8月31日大會論文投稿截止。

八、會議注冊：

即日起接受報名，采用網(wǎng)上會議平臺注冊，網(wǎng)址如下：

http://wccm2017.medmeeting.org/cn

或微信掃描右側(cè)會議平臺二維碼，點擊“報名參會”即可。

九、會議咨詢聯(lián)系方式如下：

《世界中醫(yī)藥》雜志社：魏金明、徐暉、徐穎、王明

電子郵箱：sjzyyzz@vip.126.com，電話：010-58650236/58650023/58239055

泰國中醫(yī)師總會咨詢處(僅接受泰國、新加坡、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、越南、緬甸、老撾、柬埔寨、文萊地區(qū)等東盟十國地區(qū)的參會專家報名)：

聯(lián)系人：張永發(fā)、楊秀專、賈宗亢、葉峰

電子郵箱：wctcm2017@hotmail.com，電話：+66-814350636/896641681/890739192

更多會議信息，歡迎掃描右方二維碼，關(guān)注世界中醫(yī)藥大會官方微信公眾平臺

世界中醫(yī)藥大會組委會

2017年7月12日

Extraction Technology Optimization of Yangyin Anshen Granules

Yuan Liuping1,2, Luo Xiaoshan2, Sun Dongmei2, Wu Xiaobin1,2, Wang Nuolin2

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2GuangdongSecondTraditionalChineseMedicineHosiptal(GuangdongResearchInstituteofTraditionalChineseMedicineManufacturingTechnology),GangdongProvincialKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchandDevelopment,Guangzhou510095,China)

Objective:To optimize the extraction process of Yangyin Anshen granules.Methods:To observe the effect of Yangyin Anshen granules on sleeping of petobar-bital sodium mice in order to optimize the best extraction technololgy of Yangyin Anshen prescription.Pharmacological results shows that with composite score of extraction rate of spinosin which in the Gentleman medicine ziziphi spinosae semen and dry extract rate as comprehensive evaluation indexes, orthogonal test was used to optimize the water extracting technology.Then with composites score of retention rate of spinosin and impurity removing efficiency as comprehensive evaluation indexes, orthogonal test was used to optimize the alcohol precipitation technology.Results:Optimum water extraction technology conditions were as follows:boiled the herbs with eight times the amount of water for thrice, one hour for each time, and three times in total.Optimum alcohol precipitation technology conditions were as follows:condensed the relation density of the liquor as in 1.25(60 ℃), adding alcohol to 80% of alcohol concentration and depositing it in the refrigerator at 4 ℃ for 36 h.Conclusion:Optimized extraction technology is stable and feasible, which can provide basis for molding technology of Yangyin Anshen granules.

Yangyin Anshen granules; Extraction technology; Orthogonal test

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.08.049