超高效液相色譜串聯飛行時間質譜法測定水產品中18種磺胺類化合物

熊 雯 易路遙 晏 亮 陸 慶 虞雪軍 章 紅

(江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心, 南昌 330029)

超高效液相色譜串聯飛行時間質譜法測定水產品中18種磺胺類化合物

熊 雯 易路遙 晏 亮 陸 慶 虞雪軍 章 紅*

(江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心, 南昌 330029)

采用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)結合QuEChERS凈化處理，對淡水產品中18種磺胺類化合物進行準確的鑒定。Chromalynx XS軟件將化合物的保留時間以及一級母離子精確質量數作為定性依據，篩查樣品中陽性化合物，對疑似陽性化合物進行人工比對二級碎片離子信息，以進一步確證陽性化合物。本實驗對草魚、黃鱔、螃蟹3種淡水產品基質效應進行考察，基質匹配外標法定量，結果表明，在50～1000μg/kg濃度范圍內，18種目標化合物線性關系良好，方法檢出限為2～20μg/kg，對3種基質在200、400、800μg/kg 3個添加水平的18種磺胺類化合物進行測定，回收率在70.0～124.6% 之間。

超高效液相色譜串聯飛行時間質譜 QuEChERS凈化 磺胺類化合物

磺胺類藥物(SAs)易造成人體泌尿系統損害、破壞人的造血系統，并具有致癌性及過敏性反應[1,2]。由于磺胺類藥物具有抗菌譜廣、高效、性質穩定、價格低廉等特點，水產養殖戶長期大量使用磺胺類藥物，造成水產品藥物殘留嚴重現象, 從而影響人類的健康并造成機體耐藥性[3,4]我國農業部235號公告規定磺胺類藥物在肌肉中的殘留總量控制在100μg/kg內[5]。

目前磺胺類藥物殘留檢測的前處理方法有液液萃取法[6,7]、加速溶劑萃取法[8]、固相萃取小柱法[9,10]和QuEChERS法[11,12]等，前3種方法在有機溶劑消耗大、設備復雜、成本高、操作繁雜等方面存在不足。而QuEChERS是一種快速、簡單、廉價、高效、可靠、安全的前處理方法，其早已運用于農藥殘留檢測的官方方法AOAC 2007.01和歐盟CEN 2002/657/EC,近年來，在獸藥檢測方面也得到了廣泛運用。水產品中含大量蛋白質和脂肪，采用高效的前處理方法對于準確檢測其中磺胺藥物殘留具有重要意義。

超高效液相色譜-電噴霧-串聯四極桿質譜法是檢測動物源性食品中藥物殘留的重要方法，由于受儀器掃描速度限制，檢測通量有限且只適合已知目標物的檢測。隨著高分辨質譜技術的發展，飛行時間質譜法憑借高通量、高分辨率、譜庫檢索、不依靠標準品也可分析等能力開始在痕量分析領域得到應用[13]。

本研究中，采用QuEChERS方法進行前處理，結合液相色譜-高分辨飛行時間質譜法聯用技術，建立了18種磺胺類藥物的HPLC-QTOF-MS一級精確質量數據庫與相應二級譜庫。應用一級數據庫對具有明顯特征離子的磺胺獸藥進行鑒定，對疑似磺胺化合物進行二級確證，該方法可以快速、準確對水產品中磺胺化合物篩查定性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-Q-TOF質譜儀(美國Waters)，色譜柱C18(美國Waters)；離心機(美國ThermoFisher)；渦旋混合器(德國IKA)。

18種磺胺類標準品購自Sigma及Dr.Ehrenstorfer GmbH司，純度均大于95%；乙腈、甲醇等有機試劑均為色譜純(Sigma)；NaCl為分析純(國藥集團)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)(島津公司)。

1.2 材料

草魚、黃鱔、螃蟹(市售)。

1.3 標準溶液的制備

分別準確稱取各種SAs的標準品25mg于50mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解，用乙腈定容至刻度，配制濃度為 500 mg/L 的單標儲備液，于-20℃條件下儲存。分別移取0.8mL 各單標儲備液于 50mL 容量瓶中，用初始流動相定容至刻度，配制濃度為8mg/L混合標準儲備液，于 -20 ℃條件下儲存。移取適量混合標準儲備液于容量瓶中，用初始流動相定容至刻度，逐級稀釋成 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.0mg/L 的混合標準工作液，于 4℃ 條件下儲存備用。

1.4 色譜-質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色譜柱；柱溫40℃；進樣量:1μL；流動相:A相為5mmol乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B相為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序： 0～1.2min，98%A；1.2～5.0min，98～80%A；5.0～6.0min，80%A；6.0～8.0min，80～2%A；8.0～10.0min，2%A；10.0～11.0min，2～98%A；11.0～15.0min，98%A；流速：0.4mL/min。

離子源：ESI源；掃描方式：正離子掃描；掃描范圍：m/z100～1000；毛細管電壓：3000V；干燥氣溫度500℃，干燥氣流速1000L/h；錐孔氣流速 50L/h；錐孔電壓40V；碰撞能 15～40V (MS/MS采集時)；質譜采集時間：2.0～11.0min 。

1.5 樣品前處理

稱取5g經均漿后的樣品，加入5mL 5%甲酸乙腈，振蕩30s，加入4.0g NaCl，渦旋30s，8000r/min離心5min，取1mL上清液，待凈化。將1mL上清液轉移至2mL凈化管中(含PSA 50mg、C18 50mg)，渦旋30s，10000r/min 離心1min，取上清液，過0.22μm濾膜，上機分析。

1.6 數據庫的建立

1.6.1 一級精確質量數據庫

在優化的色譜-質譜條件下，對18種磺胺化合物進行一級質譜全掃描，獲得目標物的保留時間、母離子，通過Chromalynx XS軟件輸入化合物名稱、保留時間、分子式、精確相對分子質量、CAS號，建立了18種磺胺化合物的一級精確質量數據庫。

1.6.2 二級碎片離子確證

將目標物精確質量母離子在碰撞能量15～40V下進行測定，采集目標物的子離子信息。

2 結果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

SAs的提取溶劑一般采用乙腈、甲醇、乙酸乙酯及二氯甲烷[14]，本實驗選用乙腈作為提取溶劑，有以下幾個原因：①乙腈對組織滲透力強，提取效果好，而乙酸乙酯、二氯甲烷滲透能力則較差；②磺胺屬于極性偏弱的化合物，乙腈極性比甲醇弱，對大部分磺胺化合物乙腈提取效果較好；③乙腈能較好的沉淀水產品中的蛋白質，且相對于乙酸乙酯和二氯甲烷，用乙腈不會萃取出很多的油性物質，如蠟、脂肪和油性色素等。本試驗考察了乙腈、含1%甲酸乙腈以及含5%甲酸乙腈的提取效率，結果發現，純乙腈提取效果較差，而酸化乙腈具有比較好的提取效果，這可能是由于磺胺屬于弱堿性化合物，更易溶于酸性溶劑的原因。對比含1%甲酸乙腈與含5%甲酸乙腈的提取效果，發現使用5%甲酸乙腈時化合物整體表現出更高的回收率，其各化合物回收率均達70%以上。因此，選用含5%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 QuEChERS凈化條件的優化

PSA通過氫鍵和化合物作用，可去除脂肪酸、部分有機酸、糖和色素。C18吸附劑是在硅膠基質上接有十八烷基，對油脂、甾醇和維生素的去除效果顯著。結合水產品基質特性以及磺胺類化合物的理化性質，本實驗采用混合型凈化劑，并對PSA和C18的用量進行優化，結果表明50mgPSA，50mgC18時目標化合物平均回收率最高，提取凈化效果最好，本實驗室采用該組合作為最佳QuEChERS凈化劑。

2.3 色譜條件的選擇和優化

實驗考察了ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)與Agilent C18(4.6×50mm，1.7μm) 兩種色譜柱。實驗發現，使用ACQUITY UPLC BEH C18，所有化合物在7min內全部出峰，對同分異構體，也可達到比較好的分離效果；而對Agilent C18，液相時間達到25min時，同分異構體才能分開,且峰形較差。由于磺胺化合物多為堿性化合物，實驗發現，在A、B流動相中均加入0.1%甲酸,可較好的提高化合物響應。18種磺胺類化合物的總離子流圖如圖1所示。

圖1 18種磺胺類化合物的總離子流圖

2.4 一級、二級質譜定性確證

通過對樣品中18種磺胺化合物的一級母離子精確質量質譜分析，可能會出現假陽性結果，此時需對可疑化合物進行二級子離子信息確證，可進行人工比對二級碎片離子信息，以進一步確證陽性化合物。根據歐盟SANCO/12571/2013決議，當有兩個及兩個以上的特征離子匹配，則可確證其為目標物。歐盟規定，用高分辨質譜TOF進行確證時，至少需要兩個確證離子，一個分子離子和至少一個碎片離子，且質量偏差在5×10-6之內。2002/657/EU中對高分辨質譜的目標化合物進行確證評分標準為，母離子2.0分，一個子離子2.5分，至少4.0分達到定性要求。18種磺胺化合物保留時間、質譜信息整理如表1所示。

表1 磺胺化合物保留時間、質譜信息表

續表1

2.5 基質效應評價

液相色譜-串聯質譜中的基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現為離子增強或抑制作用[16]。實驗考察草魚、黃鱔、螃蟹的基質效應，在不同基質提取液和純試劑中添加標樣，對比目標化合物在基質液和純試劑中的信號峰面積，得到基質響應相對強度。結果表明，在3種水產品基質中，18種磺胺的基質效應在88.5%～118.2%之間，基質效應不明顯。

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性范圍與檢出限

選用不含18種待測組分的空白基質樣品，經1.5節樣品前處理，得空白基質溶液。分別精密吸取混合標準工作液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2mg/L )各500μL，加空白基質溶液500μL，配制成濃度為50、100、200、400、800、1000μg/L的(草魚、黃鱔、螃蟹)基質標準溶液，繪制標準工作曲線。以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，各目標化合物在50～1000μg/kg范圍內線性關系良好，相關系數(r) 為0.9942～0.9999。在基質空白樣品中添加標準溶液，以信噪比 S/N≥3確定方法檢出限(LOD)，結果為2～20 μg/kg。以草魚基質為代表，列出各化合物線性回歸方程、相關系數及方法的檢出限，見表2。

表2 草魚基質各化合物線性回歸方程、相關系數及方法的檢出限

續表2

2.6.2 回收率

以空白樣品做添加回收實驗，在草魚、黃鱔、螃蟹空白樣品中分別添加不同量的混合標準溶液(添加水平分別為200、400和800μg/kg)，每個濃度設置2個平行樣，按上述優化的實驗方法測定各種磺胺類藥物的回收率。3種水產品中，18種磺胺樣品的回收率均在70.0%～124.6%之間。其中，草魚平均回收率為74.3%～107.8%之間；黃鱔樣品的平均回收率在83.7%～103.0%之間；螃蟹樣品的平均回收率在70.5%～96.6%之間。

3 結論

建立了針對3種水產品基質中18種磺胺類藥物的LC-Q-TOF的篩查與確證方法，對提取試劑、凈化吸附劑條件進行優化，并對基質效應及方法學進行評價，本實驗方法將QuEChERS 前處理與高分辨質譜檢測結合，實現草魚、黃鱔、螃蟹中目標化合物的快速準確篩查分析，本方法快速、高效、準確度高。

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Determination of 18 sulfonamides in fish products by UPLC-QTOF-MS .

Xiong Wen, Yi Luyao, Yan Liang, Lu Qing, Yu Xuejun, Zhang Hong*

(Jiangxi Institute For Drug Control, Jiangxi Drug and Medical Devices Quality Engineering Center, Nanchang 330029, China)

The accurate mass and retention time were utilized to screen the positive compounds by Chromalynx XS. The suspected sulfonamides were evaluated using artificial comparison of MS2ions for the futher identifying．The matrix effects in three kinds of typical foods were investigated and the quantification was carried out by matrix-matched with external standard method.The results demonstrated that the linear ranges were from 50μg/kg to 1000μg/kg with good correlation coefficients. The method detection limits were in the range of 2μg/kg to 20μg/kg. The average recoveries at three spiked levels were in the range of 70.0%-124.6% for grass carp，ricefield eel and crab．

ultra performance liquid chromatography-Q-time of flight mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；QuEChERS sample preparation；sulfonamides

江西省科技計劃項目[20142BBF60028]；江西省食品藥品監督管理局科技計劃[2015SP04]

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.04.009

2017-02-22

熊雯，女，1983年生，中級理化檢驗師，主要從事食品藥品檢驗研究，E-mail：2163809168@qq.com。

章紅，女，1968年生，主任藥師。