響應面法優化萎縮芽孢桿菌BsR05發酵培養基

戴寶,扈進冬，尹姍姍，李紀順*，魏艷麗

(1.山東泰諾藥業有限公司，山東 諸城262200； 2.山東省科學院生態研究所，山東 濟南250014； 3.山東省植物保護總站，山東 濟南250100)

響應面法優化萎縮芽孢桿菌BsR05發酵培養基

戴寶1,扈進冬2，尹姍姍3，李紀順2*，魏艷麗2

(1.山東泰諾藥業有限公司，山東 諸城262200； 2.山東省科學院生態研究所，山東 濟南250014； 3.山東省植物保護總站，山東 濟南250100)

為了提高萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus BsR05發酵液的芽孢產量，采用響應面法對BsR05發酵培養基的最佳工藝條件進行了優化。通過Plackett-Burman 實驗，篩選出玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O為影響產孢的主要因子。采用最陡爬坡路徑法確定3個因素的響應中心點及最適濃度范圍，最后，通過Box-Behnken設計建立主要培養基成分與芽孢產量之間的回歸關系，并確定發酵培養基最佳配方為葡萄糖5 g/L、玉米粉15.9 g/L、豆粕40.0 g/L、K2HPO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、(NH4)2SO42.1 g/L、MgSO4·7H2O 0.40 g/L、MnSO40.02 g/L。經重復實驗驗證，平均芽孢含量與預測芽孢含量基本一致，發酵液中BsR05的芽孢產量從優化前的4.73×109CFU/mL 提高到6.02×109CFU/mL。

萎縮芽孢桿菌；培養基優化；響應面分析

隨著國家對生態環境、農業可持續發展的重視，人們也更加注重食品安全。目前，農產品的出口以及食品貿易中農藥殘留的標準正逐步提高[1]，國家也相繼出臺實施化學農藥零增長、加速生物農藥發展的政策，作為新型農藥代表的生物農藥產業將具有廣闊的發展前景。芽孢桿菌類殺菌劑由于其可以產生抗逆的芽孢，并且生防功能多樣，已經成為我國微生物農藥的主要類型之一[2-6]。截止2016年4月，農業部登記的生物農藥中，各種芽孢桿菌類殺菌劑有101個。在產品的開發過程中菌株是根本，發酵工藝是關鍵。然而，由于我國生物農藥研發單位和生產企業的發酵工藝及制劑研究技術力量還比較薄弱，造成了發酵成本偏高，從而導致產品成本高。與此同時，生物農藥的制劑劑型單一、防治效果不理想等問題，影響了其在農業生產中的應用推廣[7]。

萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)是芽孢桿菌屬的一個重要種，國內也稱枯草芽孢黑色變種[8]，可以產生耐受不良環境的孢子，能在80 ℃以上的溫度生長，抗性強，無致病性，在農業上已發現其對小麥全蝕病、棉鈴疫病、赤霉病等多種植物病害具有良好的防治效果[9]。菌株BsR05是本實驗室從保護地蔬菜土壤中分離篩選到的一株生防菌，經鑒定為萎縮芽孢桿菌，該菌株對灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、串珠鐮刀菌(FusariummoniliformeSheld)、鏈格孢(Alternariaalternata)等多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用，在溫室盆栽試驗中對防治黃瓜灰霉病效果顯著，具有較高的應用潛能和研究價值。為了進一步降低發酵成本，本研究采用Plackett-Burman設計、最陡爬坡路徑法及響應面試驗設計法對BsR05發酵培養基配方進行優化，期望獲得液體深層發酵培養高產孢量的發酵培養基配方，實現該菌株在企業中大規模化生產及商業化應用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

萎縮芽孢桿菌BsR05菌株，由山東省科學院生物研究所應用微生物實驗室分離和保存。玉米粉、豆粕為市售，過80目篩備用。其他試劑均為國產分析純。

1.2 培養基

1.3 方法

1.3.1 發酵培養條件

采用500 mL三角瓶裝入50 mL液體發酵培養基，按照體積分數5%接種量接入種子發酵液(培養條件)，在32 ℃，180 r/min 的振蕩培養箱中振蕩培養48 h后測定發酵液中芽孢含量。

1.3.2 培養基的優化

依據Minitab16 軟件的Plackett-Burman實驗設計，篩選出BsR05發酵培養基中影響芽孢產量的主要因素，然后，應用最陡爬坡路徑法確定主要因素的響應中心點及最適濃度范圍，最后通過Box-Behnken設計和響應面分析確定最佳培養基配方。

1.3.2.1 Plackett-Burman 設計法

經勘測，閘底（即堰頂）高程為2.69 m，與現今溫瑞塘河通常水位2.62 m接近。溫州地處濱海，地勢西高東低，河流源短流急，降水后河道水位迅速升高，并經常受潮水頂托，造成城市內澇。古時汛期，臺風或暴雨來臨前，閘工根據氣象情況，將水閘全部打開對河水進行預排，騰空溫瑞塘河庫容，調蓄洪水，防止發生內澇。由此可見，閘底（即堰頂）高程即為汛限水位，用以指導汛期防洪調度。

選取初始發酵培養基中的各個組分，采用Minitab16 軟件的Plackett-Burman 設計篩選發酵培養基中影響芽孢產量的主要因素。選擇8 因子2 水平的實驗設計，每個因素取高低兩個水平(表1)。全面考察初始發酵培養基中8個組分對芽孢產量的影響。

表1 Plackett-Burman實驗設計因子和水平

Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman 單位：g/L

變量符號水平-11A葡萄糖510B玉米粉2030C豆粕粉4060 D(NH4)2SO424EKH2PO411．5FK2HPO434 GMgSO4·7H2O0．20．3HMnSO40．020．03

1.3.2.2 最陡爬坡路徑法

根據Plackett-Burman實驗得出的一次擬合方程，確定因素取值的中心點。并根據擬合方程中各變量的系數確定主要因素的爬坡方向和變化步長，發酵培養基中除去主要因素之外的其他組分和初始培養基一致。然后，根據爬坡實驗中發酵液芽孢量的變化趨勢，確定Box-Behnken實驗設計的中心點及最適質量濃度范圍。

1.3.2.3 響應面分析

根據最陡爬坡實驗結果，確定Plackett-Burman 實驗主要因素的最適質量濃度范圍。采用Minitab16 軟件中Box-Behnken設計3 因素優化實驗，響應面分析各因素之間的相互作用。

1.3.2.4 驗證實驗

采用確定的最佳優化培養基進行3 次重復發酵實驗，取3次實驗結果的平均值與預測值比較，驗證模型的可靠性，確定最終的優化發酵培養基配方。

1.3.3 芽孢含量測定

取發酵液1 mL于1.5 mL無菌離心管中，在80 ℃水浴鍋中水浴處理15 min，采用稀釋涂布法計數芽孢生長數[10]。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗結果分析

Plackett-Burman實驗設計和結果見表2。Plackett-Burman 設計的各因素水平及效應評價見表3，根據實驗設計的回歸分析結果的P值可以確定對發酵液芽孢含量具有顯著影響的因子由大到小依次是玉米粉、MgSO4·7H2O 和(NH4)2SO4，從而確定這3 個因子作為下一步實驗的關鍵因素。

表2 Plackett-Burman實驗設計和結果

續表2

序號ABCDEFGHY/(109CFU·mL-1)6-11-1-1-11113．8271-111-11-1-13．308-1-1111-1113．949111-111-113．121011-111-11-13．5211-1-1-1-1-1-1-1-14．08121-11-1-1-1114．54

Plackett-Burman實驗設計的回歸分析結果(表3)表明，R-Sq(調整)為93.5%，說明一次擬合方程擬合良好，可以反映實際實驗情況。玉米粉(B)、(NH4)2SO4(D)和MgSO4·7H2O(G)的可信度水平均高于95%(P<0.05)，因此被視為對發酵芽孢數有顯著影響的因素。而其他5個因素的可信度水平均低于95%(P>0.05)，則認為對發酵芽孢數無顯著影響。

表3 Plaekett-Burman實驗設計的回歸分析結果

注：S = 0.172 568， R-Sq= 98.2% ， R-Sq(調整) = 93.5%。

根據Plackett-Burman實驗結果確定玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O是影響萎縮芽孢桿菌BsR05發酵液芽孢產量的主要因素，其中MgSO4·7H2O是正效應因子，在設計最陡爬坡實驗時，濃度依次增加；玉米粉和(NH4)2SO4是負效應因子，濃度依次降低。最終確定3種主要因素進行最陡爬坡路徑實驗的最適濃度范圍和結果見表4。BsR05發酵液中芽孢含量隨MgSO4·7H2O、玉米粉和(NH4)2SO4濃度的變化先上升后下降。在MgSO4·7H2O 0.4 g/L、(NH4)2SO42 g/L、玉米粉 15 g/L 時，BsR05發酵液中芽孢含量最高，選擇此點作為響應中心點，進行進一步的響應面分析。

表4 最陡爬坡路徑實驗設計和結果

2.2 響應面設計結果分析

依據Minitab16 軟件的Box-Behnken 設計進行3因素3水平實驗設計，各因素編碼水平見表5。每個處理重復3次，Box-Behnken實驗設計和結果見表6。用Minitab16軟件對設計實驗進行方差分析并對實驗結果進行二次回歸擬合，結果如表7。

表5 Box-Behnken設計編碼水平表

表6 Box-Behnken設計和結果

表7 Box-Behnken實驗設計回歸分析結果

注：S= 0.215 438 ，R-Sq=98.6% ，R-Sq(調整) =96.5%。

利用Minitab16.0回歸擬合實驗數據，獲得芽孢產量對發酵參數的三元二次回歸方程:

Y=(6.03)-0.265X1+0.0.175X2+0.07X3-0.697X12-0.717X22-0.867X32-0.190X1X2+0.025X1X3+0.015X2X3。

該模型的決定系數R-Sq(調整)為96.5%，表明該回歸方程的擬合程度較好，實驗誤差小，能較好地反映3種主要因素與芽孢產量之間的關系，因此，可以用于BsR05發酵液中芽孢產量的分析和預測。采用Minitab軟件繪制響應面圖，如圖1所示。

A 固定水平：(NH4)2SO4 2 g/L;B 固定水平：玉米粉 15 g/L;C 固定水平：MgSO4·7H2O 0.4 g/L。圖1 3種主要因素交互作用對BsR05發酵產孢影響的響應面圖Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of 3 major factors on sporulation of BsR05 fermentation

Minitab16回歸擬合方程及響應面圖表明，當(NH4)2SO4濃度不變時，產孢量隨著玉米粉和MgSO4·7H2O濃度的升高呈現先升高后降低的趨勢，并且MgSO4·7H2O變化幅度較玉米粉大，主要原因是MgSO4·7H2O在特定濃度下可以加速產孢；當玉米粉濃度不變時，產孢量隨 (NH4)2SO4濃度的升高呈緩慢增加趨勢，伴隨MgSO4·7H2O濃度的升高產孢量增加速度較快，且呈現先升高后降低的趨勢；當MgSO4·7H2O濃度不變時，產孢量隨著玉米粉和(NH4)2SO4濃度的升高同樣呈現先增大后降低的趨勢，但變化幅度略微平緩。此外，根據響應面圖分析，可以發現在較高濃度下的玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O不利于BsR05發酵產孢。

2.3 驗證實驗結果分析

采用Minitab16 軟件中的響應優化器可以獲得上述3種主要因素的最優值點為玉米粉15.86 g/L、(NH4)2SO42.09 g/L和MgSO4·7H2O 0.405 g/L，在發酵條件下預測的發酵產芽孢的最大數為6.08×109CFU/mL。在該發酵條件3次重復驗證實驗結果分別為5.87×109CFU/mL、6.15×109CFU/mL和6.02×109CFU/mL，平均值為(6.02±0.09)×109CFU/mL，與預測值 6.08×109CFU/mL基本一致，實驗數值和預測值擬合性高，說明建立的模型是有效的。最后確定經響應面優化后BsR05菌株的發酵培養基配方為：葡萄糖5 g/L，玉米粉15.9 g/L，豆粕40.0 g/L，K2HPO43.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，(NH4)2SO42.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO40.02 g/L，水1 000 mL。

3 討論

發酵培養基的優化是微生物殺菌劑實現工業化生產的重要環節。Plackett-Burman設計法可以快速、有效地從大量的影響因素中篩選出其中的關鍵因素[11]，已成為微生物發酵培養基優化過程中顯著因子篩選的通用方法之一。在此基礎上使用響應面分析法可以進一步分析、篩選并獲得多個顯著因子之間交互作用的影響，可以同時優化影響響應值的多個變量。與其他優化方法相比，響應面法可以減少實驗次數、用時更短，同時還可獲得多元二次回歸方程以精確預測最終產量，結果可靠，常被用于微生物發酵培養基及發酵過程的條件優化。如張丹等[12]利用響應面法對一株產蛋白酶菌株進行發酵條件優化，優化后該蛋白酶酶活力最大值為2504.8 U，酶活力較優化前提高了4倍。劉京蘭等[13]采用響應面法對生防解淀粉芽孢桿菌CC09發酵產iturin A進行了優化，優化后生防解淀粉芽孢桿菌CC09合成iturin A的產量達501 mg/L，較優化前提高了4.2倍，且發酵成本是利用改良LB培養基的4.3%。李悅等[14]在單因素實驗的基礎上，利用Plackett-Burman實驗分析及響應面法對纖維素酶高產菌小刺青霉(Penicilliumspinulosum)16-7進行發酵工藝條件的優化，優化后菌株產內切纖維素酶活(CMCase activity)為387.58 U、濾紙酶活(filter paper activity)為128.86 U，比優化前提高49.07 %。李雯靜等[15]采用響應面法對一株羊源丁酸梭菌的發酵工藝進行了優化，優化后芽胞數為1.478×108CFU/mL，是優化前的2.7 倍。上述例證均表明，響應面分析法是一種科學、有效的優化分析方法。

芽孢桿菌是一種重要的生防因子，可以定殖于寄主植物根、莖、葉部位，從而與病原菌競爭營養和侵染位點；有些芽孢桿菌還可以分泌抗菌物質、抑制病原菌生長；可以誘導植物抗病性、抵御植物病原菌侵害，從而有效地防治植物病害。而且，由于芽孢桿菌能夠產生抗逆的芽孢的抵御不良環境的影響，是一類理想的生防菌[16]。微生物菌劑中的活菌數是保證產品效果的重要指標，活菌數量降低通常會影響生防制劑的使用效果，造成微生物殺菌劑在使用過程中防治效果不穩定。芽孢桿菌產生的芽孢是一種抗逆休眠體，能夠有效地抵御不良環境影響，從而保證產品中活菌含量，提高產品保存期。因此，以芽孢產量為指標優化BsR05的發酵培養基在生產上更具有實際意義，為其工業化發酵高產芽孢工藝奠定了基礎。該發酵參數在中試和工業化的實際發酵過程中，還有待于進一步的驗證。

[1]GONZALEZ-COLOMA A, REINA M, DIAZ C E, et al. 3.09-Natural product-based biopesticides for inset control[EB/OL].[2016-04-03]. https://www.mysciencework.com/publication/show/ee4230d466305d4547e3d7fed6d4baf5 .

[2]黃海嬋,裘娟萍.枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進展[J]. 浙江農業科學,2005 (3) : 213-215.

[3]程洪斌,劉曉橋,陳紅漫.枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進展[J]. 上海農業學報, 2006, 22 (1): 109-112.

[4]梁文平，鄭斐能，王儀，等. 21 世紀農藥發展的趨勢：綠色農藥與綠色農藥制劑[J]. 農藥, 1999, 38 (9): 1-2.

[5] 陳蕾,王倩,張惠軍.芽孢桿菌最新分類研究進展[J]. 河南化工, 2011, 28 (3): 14-18.

[6]ONGENA M, JACQUES P. Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol[J]. Trends in Microbiology, 2008, 16 (3): 115-125.

[7] 邱德文. 生物農藥研究進展與未來展望[J]. 植物保護, 2013, 39 (5): 81-89.

[8]劉波,李紅,姚粟，等.枯草芽孢桿菌黑色變種ATCC9372的特性及其應用[J]. 中國消毒學雜志, 2009, 26 (2): 236-237.

[9]辛海峰,孟艷艷,李建宏, 等.一株萎縮芽孢桿菌在小麥中的定植及對赤霉病的防治[J]. 生態學雜志, 2013, 32 (6): 1490-1496.

[10] 杜連祥. 工業微生物學實驗技術[M]. 天津: 天津科學技術出版社, 1992: 104.

[11] CAI M H, ZHOU X S, SUN X Q, et al. Statistical optimization of medium composition for aspergiolide a production by marine-derived fungusAspergillusglaucus[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2009; 36 (3): 381-389.

[12] 張丹, 閔偉紅, 劉景圣,等. 響應面法優化蛋白酶菌株發酵條件[J]. 食品科學, 2011， 32 (13): 248-253.

[13] 劉京蘭, 蔡勛超, 薛雅蓉, 等. 生防解淀粉芽孢桿菌CC09合成iturin A條件的響應面優化[J]. 中國生物防治學報, 2016， 32 (2): 235-243.

[14] 李悅, 薛橋麗, 李世俊, 等.纖維素酶液體發酵工藝條件的響應面法優化[J/OL]. 食品科學, 2014， http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20140730.1627.108.html.

[15] 李雯靜, 李則靜, 田中元, 等.羊源丁酸梭菌HDRyYB1發酵工藝的優化[J]. 微生物學通報, 2016, 43 (3): 534-540.

[16] 陳志誼. 芽孢桿菌類生物殺菌劑的研發與應用[J]. 中國生物防治學報, 2015, 31 (5): 723-732.

Optimization of fermentation medium composition forBacillusatrophaeusBsR05 by response surface method

DAI Bao1, HU Jin-dong2, YIN Shan-shan3, LI Ji-shun2*, WEI Yan-li2

(1. Shandong Tenov Pesticides Co.Ltd., Zhucheng 262200, China; 2.Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Plant Protection Station of Shandong Province, Jinan 250100, China)

∶To increase the spore production ofBacillusatrophaeusBsR05, a response surface method was applied to optimize the technological conditions of BsR05 fermentation medium. Corn flour, (NH4)2SO4and MgSO4·7H2O were selected as the major factors affecting sporulation by means of Plackett-Burman design. The method of steepest ascent path was adopted to determine the response center and the optimal concentration range of these 3 factors. Finally, the regression relationship between the main medium composition and the spore yield was established by Box-Behnken design. The optimal formula for the fermentation medium was determined as follow：glucose 5 g/L，corn flour 15.9 g/L, soybean meal 40 g/L, K2HPO43.0 g/L, KH2PO41.0 g/L, (NH4)2SO42.1 g/L, MgSO4·7H2O 0.40 g/L and MnSO40.020 g/L. After repeated experiments, it was verified that the average spore content was basically consistent with the predicted spore content, and the concentration of the spore was increased from 4.73×109CFU/mL to 6.02×109CFU/mL after the optimization.

∶Bacillus atrophaeus；medium optimization；eesponse surface methodology

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.006

2016-10-02

山東省2015年度農業重大應用技術創新項目;山東省科學院-棗莊市產業技術研發聯合基金(201510)

戴寶(1964—)男，研究方向為生物肥料和生物農藥。

*通信作者，李紀順(1970—)，男，高級工程師，研究方向為生物肥料和生物農藥。E-mail：yewu2@sdas.org

S476

A

1002-4026(2017)04-0031-07