土壤桿菌固氮、溶磷活性及對植物的促生作用

魏艷麗，Maarten RYDER ，李紀順，李玲，楊玉忠，楊合同,3*

(1. 山東省科學院生態研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014； 2. 澳大利亞阿德萊德大學農業食品葡萄酒學院，阿德萊德 5064；3. 山東省黃河三角洲可持續發展研究院，山東 東營 257000)

【農業微生物】

土壤桿菌固氮、溶磷活性及對植物的促生作用

魏艷麗1，Maarten RYDER2，李紀順1，李玲1，楊玉忠1，楊合同1,3*

(1. 山東省科學院生態研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014； 2. 澳大利亞阿德萊德大學農業食品葡萄酒學院，阿德萊德 5064；3. 山東省黃河三角洲可持續發展研究院，山東 東營 257000)

通過選擇性培養基，定性和定量檢測了26株土壤桿菌的固氮和溶磷活性，通過盆栽檢測了澳洲生防菌株K1026對黃瓜和小麥的促生長作用。結果顯示，包括致病性和無致病性的26株土壤桿菌均可在無氮培養基上正常生長；其中19株具有溶磷活性， K1026對磷酸鈣液體培養基的溶磷量為109.11 μg/mL；對黃瓜幼苗根系生長具有顯著促進作用，但對小麥生長沒有明顯影響。

土壤桿菌；AgrobacteriumrhizogenesK1026；固氮；溶磷；促生作用

土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)K1026通過產生土壤桿菌素A84和A434[1]，對致病性土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染引起的冠癭病具有較好的防治效果，已廣泛應用于核果類果樹冠癭病的生物防治中[2]。目前對生防菌株K1026的研究主要集中于對核果類果樹冠癭病的防治作用和作用機理方面[3-4]，而在其固氮、溶磷和促生作用方面鮮有報道。本文初步檢測了26株土壤桿菌的固氮和溶磷活性，并研究了生防菌株K1026對黃瓜和小麥幼苗生長的影響，以期為開發高效微生物菌肥提供種質資源，也為菌株K1026的田間應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和植物

1.1.1 供試菌株

生防菌株K1026由澳大利亞阿德萊德大學Maarten Ryder教授提供，屬于非致病性發根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)。25株致病性土壤桿菌(A.rhizogenes)如S-30、K108等由本實驗室分離自山東泰安大櫻桃根癌組織和感病土壤中，可侵染櫻桃根部產生根癌組織。參比菌株為越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)B418，保存于本實驗室，已驗證具有固氮、溶磷和促生活性[5]。

1.1.2 供試植物

供試黃瓜品種為中農16號；供試小麥品種為濟麥22號。

1.2 培養基

1.2.1 YMA培養基

K2HPO40.5 g/L；CaCl20.2 g/L；NaCl 0.2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；酵母浸粉 1 g/L；甘露醇 10 g/L；微量元素(1 000×)2 mL，固體培養基加入瓊脂 15 g/L，調整pH至 7.2～7.4，121 ℃滅菌 20 min。其中微量元素(1 000×)的配方為：FeCl35 g/L；MnCl20.1 g/L；ZnCl20.5 g/L。

1.2.2 無氮培養基

KH2PO40.2 g/L；CaCO35.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；NaCl 0.3 g/L；甘露醇 10 g/L；CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂 15 g/L，調整pH=7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.2.3 Pikovskaya 培養基[6]

葡萄糖 10 g，酵母粉 0.5 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，磷酸鈣 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH為7.0～7.5，瓊脂 15 g，121 ℃滅菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 土壤桿菌固氮能力定性檢測

將包括菌株K1026在內的26株土壤桿菌經YMA培養基活化后，分別用滅菌牙簽點接于無氮固體培養基上，26 ℃培養3 d后檢測菌株生長情況。

1.3.2 土壤桿菌溶磷活性測定

溶磷能力定性實驗采用點接Pikovskaya培養基的方法，將26株土壤桿菌經YMA活化后，分別用滅菌牙簽點接于Pikovskaya 培養基上，26 ℃培養4～7 d后，測量溶磷圈直徑。

參考Li等[7]方法進行定量實驗，挑選溶磷能力強的菌株，在YMA培養基上培養48 h，然后用無菌水洗下培養物制備菌懸液，按質量分數1%的接種量接種于液體Pikovskaya培養基中，26 ℃、170 r/min搖床培養7 d。采用磷鉬藍分光光度法測定并計算發酵液中可溶性磷的含量，以滅菌后未接種的空白 Pikovskaya液體培養基作為對照。

1.3.3 生防菌株K1026對黃瓜和小麥幼苗生長的影響

實驗在山東省科學院生態研究所溫室中進行。實驗用土為普通蔬菜地土壤加質量分數為30%的河沙，充分混勻。將K1026和B418菌株分別在YMA和B418培養基上培養48 h ，然后分別用無菌水洗下菌體，調整菌懸液濃度為5×108CFU/mL。用以上兩種菌懸液分別浸泡黃瓜和小麥種子2 h，同時設清水浸種對照。每盆播種8粒，待黃瓜和小麥分別長出4片葉后，每盆定苗4株。分別于播種后6～7 d調查出苗率，42 d后測定幼苗生長指標，包括根長、株高、根部鮮重(干重)和整株鮮重(干重)。

1.3.4 數據分析

采用Excel 2007進行數據統計分析，用Ducan’s方差分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 土壤桿菌在無氮培養基上的生長

檢測了包括K1026在內的26株土壤桿菌在無氮培養基上的生長情況，結果發現，無論是致病性土壤桿菌還是生防菌K1026，所有26株菌在無氮培養基上均可正常生長。

2.2 土壤桿菌的溶磷活性

檢測的26株土壤桿菌在Pikovskaya固體培養基上培養7 d，其中19株可觀察到明顯的溶磷圈(圖1)，溶磷圈直徑1.08～1.22 cm之間。

采用磷鉬藍分光光度法，定量檢測了3株土壤桿菌的溶磷活性，發現26 ℃搖床培養72 h，測試的3株土壤桿菌均具有較好的溶磷效果。其中生防菌K1026發酵液中可溶磷含量可達到109.11 μg/mL，病原菌S-30發酵液中可溶磷含量達140.11 μg/mL，土壤桿菌K108發酵液中可溶磷含量最高，為162.18 μg/mL(圖2)。

圖1 部分土壤桿菌的溶磷活性Fig.1 Phosphate solubilizing activity of Agrobacterium strains.

圖2 部分土壤桿菌的溶磷活性定量檢測Fig.2 Quantitative determination of phosphate solubilizing activity of 3 strains in liquid medium

2.3 生防菌株 K1026對黃瓜幼苗生長的影響

由表1可知，與對照相比添加土壤桿菌K1026的處理黃瓜根的長度增加25.49%，根部干重增加62.96%，均達到差異顯著水平；但株高和地上部分干重兩個指標與對照無顯著性差異。伯克霍爾德氏菌B418處理的黃瓜種子，除能增加株高外，其他指標與對照均無顯著性差異。

表1 不同菌劑處理對黃瓜幼苗生長的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示經LSD檢驗在P<0.05水平上差異顯著。

2.4 生防菌株 K1026對小麥幼苗生長的影響

生防菌株K1026對小麥根系生長沒有明顯的影響，對整株生長的促進作用也較小；而B418對小麥生長有促進作用，與對照水處理相比，對根系干重的增長率為26.32%，對植株地上干重增長率達到6.12%，見表2。

表2 不同菌劑處理對小麥幼苗生長的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示經LSD檢驗在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

土壤桿菌(Agrobacterium)在分類學上屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)，一直被認為由于不固定氮而區別于根瘤菌和其他自生固氮菌[8-9]。本文檢測的26株土壤桿菌均可以在無氮培養基上正常生長，初步推測固氮活性是該類菌株的共性。通過對土壤桿菌K84菌株(與菌株K1026具有相同遺傳背景)基因組序列比對，發現了與根瘤菌結瘤相關的nod類基因。王麗等[10]研究了土壤桿菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性，結果表明該菌具有自生固氮活性，這與本文研究結果一致。

已報道的溶磷微生物主要有細菌、真菌和放線菌[11-12]。本文首次定性、定量檢測了土壤桿菌的溶磷活性，發現26株待測菌株中有19株在Pikovskaya固體培養基上生長并可產生明顯的溶磷圈，并且首次驗證了生防菌株K1026的溶磷活性。作者通過檢索發現菌株K84基因組中含有多個磷酸酶基因，推測土壤桿菌可產生胞外酶促進磷酸鈣的轉化。

在促進黃瓜幼苗生長方面，本文研究發現土壤桿菌K1026浸種處理，對黃瓜根長和根部干重都有顯著增加； Hao等[13]檢測了一株土壤桿菌D3對油菜種子根系生長的影響，結果表明土壤桿菌D3可顯著增強油菜種子根系的生長，并測定了該土壤桿菌的轉氨酶活性，驗證了轉氨酶活性高低與根系生長的長度呈現正相關。說明生防菌株K1026不僅可用于櫻桃等核果類果樹根癌病的生物防治，還可用于微生物肥料的生產起到促進植物生長的作用。

本文研究發現K1026生防菌株對小麥的根部生長沒有明顯的促進作用，推測是由于土壤桿菌在自然條件下可以趨化性地感染大多數雙子葉植物，而對小麥等單子葉植物不易侵染造成的，具體原因還需要進一步的研究。

[1]CLARE B G, KERR A, JONES D A. Characteristics of the nopaline catabolic plasmid inAgrobacteriumstrains K84 and K1026 used for biological control of crown gall disease [J].Plasmid, 1990, 23(2): 126-137.

[2]KERR A. Biological control of crown gall [J]. Australasian Plant Pathology, 2016, 45: 15-18.

[5]李紀順，陳凱，楊合同，等.伯克霍爾德氏菌B418 的生物學特性[C]//中國植物病理學會2004年學術年會論文集. 北京:中國農業科學技術出版社, 2004:432-437.

[6]PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species[J]. Microbiologiya, 1948, 17:362-370.

[7]LI J F, ZHANG S Q, SHI S L, et al. Mutational approach for N2-fixing and P-solubilizing mutant strains ofKlebsiellapneumoniaeRSN19 by microwave mutagenesis[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2011,27(6): 1481-1489.

[9]LASSALLE F, CAMPILLO T, VIAL L, et al. Genomic species are ecological species as revealed by comparative genomics inAgrobacteriumtumefaciens[J]. Genome Biology and Evolution, 2011,3: 762-781.

[10]王麗，張靜娟.土壤桿菌固氮生理特性研究[J].微生物學報,1994,34(5):385-392.

[11]林英，司春燦，韓文華，等.解磷微生物研究進展[J]. 江西農業學報，2017,29( 2)：99-103.

[13]HAO Y, CHARLES T C, GLICK B R. ACC deaminase activity in avirulentAgrobacteriumtumefaciensD3[J].Can J Microbiol, 2011, 57(4), 278-286.

Nitrogen fixation, phosphate solubilizing activity and plant growth promotion ofAgrobacterium

WEI Yan-li1, Maarten RYDER2, LI Ji-shun1, LI Ling1, YANG Yu-zhong1, YANG He-tong1,3*

(1. Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014, China; 2. School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide, Adelaide 5064, Australia; 3.Research Center of Sustainable Development in the Yellow River Delta，Dongying 257000, China)

∶Through selective medium, the function of fixing nitrogen and dissolving phosphorus of 26Agrobacteriumstrains were studied by both qualitative and quantitative analysis methods. Meanwhile, growth-promoting effect of Australian bio-control strain K1026 on cucumber and wheat was measured by pot experiment. The results showed that all the strains regardless of pathogenicity or non-pathogenicity could grow normally on nitrogen-free medium. 19 of the 26 strains had the ability to dissolve phosphorus, the Phosphate released by K1026 in Pikovskaya broth medium was up to 109.11 μg/mL , having the strongest activities among all stains. The pot experiments showed that K1026 had obvious growth-promoting effect on the cucumber seedlings, and the root length and the dry weight of the root biomass was increased by 25.49%, 62.96%, respectively, compared with the control. However, K1026 had no obvious effect on the growth-promotion of wheat.

∶Agrobacteriumtumefaciens;AgrobacteriumrhizogenesK1026; nitrogen fixation; phosphate-solubilisation; growth promotion effect

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.005

2017-05-11

山東省重點研發計劃(2016GNC113010)；2017年度山東省引進國外智力成果示范推廣項目；黃河三角洲學者工程專項

魏艷麗(1978—)，女，高級工程師，研究方向為農業微生物。E-mail: yanli_wei@163.com

*通信作者，楊合同，研究員，黃河三角洲學者特聘專家，研究方向為農業病害生物防治。E-mail: yanght@sdas.org

S436.629

A

1002-4026(2017)04-0026-05