對“胰島素休克現象”實驗的改進

周 辰, 畢 群

(北京大學 生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心, 北京 100871)

對“胰島素休克現象”實驗的改進

周 辰, 畢 群

(北京大學 生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心, 北京 100871)

“胰島素休克現象”是簡單的觀察實驗,在2016年秋季學期中,北京大學生理學實驗課程組通過增加動物數量,全班協作獲得結果,得到可以進行統計分析的數據,學生不僅完成了傳統的現象觀察內容,也在實驗設計、動物分組、統計計算等方面得到了訓練。

胰島素休克； 統計分析； 生理實驗

作為大學基礎實驗課程的生理學實驗,內容多為傳統的經典驗證性實驗,越來越難以調動學生的學習熱情。增加與實際生活相關的實驗內容是提高學習積極性的手段之一。胰島素是人體唯一的降血糖激素,由于血糖調節系統出現異常造成的糖尿病是當今的重要健康問題。我校生理學實驗中曾經進行過注射胰島素引起的低血糖效應以及休克等現象的觀察實驗[1-2],現在也有多種生理學實驗教材收錄了類似的內容[3-6]。這個實驗操作容易,準備簡單,實驗材料可以使用小鼠[1-3,5-6],也可以使用兔[3-4]或者使用魚類[3,7-8]等。雖然胰島素休克實驗可以很容易地在本科教學中開展,也能夠在一定程度上引起學生的興趣。但是目前的實驗設計都過于簡單,只能進行現象觀察,內容不夠充實,上課過程比較單調。為了更有效地利用教學時間,可以考慮增加實驗內容,例如教材中常見的注射葡萄糖或者腎上腺素[9-10]治療低血糖休克現象,或使用其他受體阻斷劑等藥物影響該現象的產生[11]。這些改進豐富了實驗內容,但是實驗結果仍然只是觀察現象,而要得到有統計意義的結果,需要足夠數量的實驗動物。在科研工作中可以進行符合統計學要求的實驗設計,但不具備在本科教學中開展的條件。鑒于實驗分組和數據分析等訓練也是本科教育的重要組成部分,可以考慮在以小組為單位分別觀察胰島素休克及挽救等現象的同時,以全班多個小組的數據總體進行統計。這樣無需大量實驗動物,并且胰島素相關實驗操作簡單、結果明確,適合進行實驗設計和統計分析的初步訓練。

在2016年秋季學期,我校生理學實驗課通過注射胰島素引起低血糖休克現象,分析其出現時間與血糖濃度和胰島素劑量的關系。對于此次實驗的結果和經驗進行了及時總結。

1 材料和方法

1.1 藥品和儀器

實驗使用的藥品包括注射用人胰島素(4 IU/mL),葡萄糖(50%),腎上腺素(0.1 mg/mL),生理鹽水(0.9%),藥品使用方式均為腹腔注射。使用家用血糖儀(歐姆龍HGM-114),通過剪斷尾尖取血測定小鼠血糖濃度。

1.2 實驗動物及分組

實驗動物使用成年的白色昆明小鼠,均為雌性。2個教學班分別有18及20名學生,各分為5組,每組使用12只小鼠,其中4只小鼠正常喂食,到實驗開始時空腹約6 h,8只小鼠空腹48 h。這些小鼠中,隨機選擇1只正常小鼠和2只空腹小鼠作為對照；3只空腹小鼠注射10 IU胰島素,剩余3只空腹小鼠和3只正常小鼠注射40 IU胰島素。

1.3 實驗過程

學生隨機取鼠,放入編號的透明塑料盒中。剪斷尾尖取血,使用血糖儀讀取其初始血糖濃度,隨后按照分組計劃注射相應劑量的胰島素,對照組注射生理鹽水。觀察小鼠出現的現象,包括比較輕微的癥狀，如抖動和呼吸急促等,以及嚴重的癥狀及驚厥和休克,例如角弓反張、抽搐和翻滾等,分別記錄發生時間。在出現嚴重反應后,再次測定血糖濃度,并隨機選擇驚厥小鼠注射1 mL葡萄糖或腎上腺素,觀察是否有挽救現象以及沒有采取挽救措施的小鼠的死亡情況。實驗結束后斷頸處死所有小鼠。

1.4 數據分析

各組實驗結束后將發生反應的時間、血糖濃度等原始數據填入總表。數據表現方式為平均值±標準誤,使用SPSS對數據結果進行統計分析,顯著性標準為0.05,如無聲明,統計方法均為studentt-test。

2 結果

2.1 發生嚴重低血糖反應的比例

2個班的實驗共使用120只小鼠,其中40只正常喂食,到實驗開始時距離上次進食約6 h,另外80只空腹小鼠,距離上次進食超過48 h。空腹小鼠在行為上與正常喂養的小鼠沒有明顯差別,但血糖濃度有極顯著差異(見圖1),空腹小鼠為正常小鼠的63.2%。

圖1 空腹小鼠(48 h)與正常小鼠血糖濃度

大多數注射胰島素的小鼠,都很快出現發抖等輕微的低血糖現象,時間在5 min以內。繼續觀察，發現部分小鼠出現不同的癥狀,包括運動性下降、呼吸急促等。0.5 h后,開始出現驚厥、翻滾甚至休克等嚴重癥狀。對出現嚴重反應的小鼠數量進行了統計,結果令人意外,注射40 IU胰島素的正常小鼠,比例為90%(27/30),遠高于注射同樣劑量胰島素的空腹小鼠的50%(15/30),2組有極顯著差異(百分比檢驗,P<0.01)。注射10 IU胰島素的空腹小鼠出現驚厥的比例為60%(18/30),稍多于空腹小鼠高劑量注射組,但沒有統計差異。

2.2 發生嚴重低血糖反應的潛伏期

進一步總結了出現嚴重低血糖反應的時間,結果顯示,在空腹小鼠中,高劑量組的驚厥時間顯著短于低劑量組,而同樣的高劑量注射后,空腹與否并不影響出現驚厥的時間(見圖2)。在出現驚厥等現象后,再次測定了小鼠的血糖,成對比較，表明血糖濃度有了極顯著的下降(見圖3)。

圖2 注射胰島素后小鼠發生嚴重低血糖反應的潛伏期

圖3 注射胰島素前與發生嚴重低血糖反應后的血糖濃度

有趣的是,發生嚴重低血糖反應的時間與小鼠注射前血糖沒有相關性。使用SPSS進行相關性分析顯示,在正常注射40 IU、空腹注射10 IU組和40 IU組中,注射胰島素前的血糖與驚厥潛伏期的相關系數分別為0.109(P= 0.612)、-0.3(P= 0.259)和0.056(P= 0.857),均無統計差異。此外,出現驚厥等嚴重癥狀的小鼠與沒有驚厥的小鼠相比,注射前的血糖沒有差異(見圖4)。這說明嚴重低血糖反應出現與否以及潛伏期時長與注射前的血糖濃度無關。驚厥后測定的血糖濃度與發生潛伏期之間的相關性也進行了檢測,注射40 IU胰島素的正常小鼠和空腹小鼠中都有顯著的負相關,相關系數分別為-0.495(P= 0.014)和-0.58(P= 0.038),注射10 IU胰島素的小鼠組中也有接近顯著差異的負相關現象,相關系數為-0.497(P= 0.05)。這些結果表明驚厥發生的越快,當時小鼠的血糖濃度越高。而2次測定的血糖濃度差值與發生驚厥的潛伏期之間也沒有相關性,這提示血糖濃度過低并不是發生胰島素休克現象的唯一原因,小鼠的個體差異也影響了發生驚厥的時間。

圖4 發生驚厥和未發生驚厥的空腹小鼠在注射胰島素前的血糖濃度比較

3 討論

3.1 上課情況與結果分析

本實驗操作比較簡單,因此上課過程十分順利,沒有發生意外情況。學生在自己組內都觀察到了應有的現象,除進行了統計分析的嚴重低血糖發生的比例和潛伏期以外,也觀察到了注射葡萄糖的挽救效果。對于對照小鼠,在驚厥小鼠注射葡萄糖后也進行了同樣劑量的葡萄糖注射,其中部分小鼠由于血糖濃度過高而死亡。注射腎上腺素的結果并不統一,有些產生挽救效果,有些造成死亡。對于這種小組合作和全班合作的實驗形式,本學期是第一次開展,課后問卷顯示,學生對此實驗比較滿意,在實驗滿意度排序中總分位于第2位。實驗結果統計分析顯示，空腹小鼠對胰島素的反應顯著小于正常小鼠,這是實驗前沒有想到的。這樣不符合預期的現象對于學生的學習是有益的,可以培養他們認真對待實驗結果、分析“異常”現象,得到更全面的訓練。本次實驗報告中,大多數學生都對此現象進行了討論,很多學生查閱資料提出了自己的解釋和假說,這對于分析結果和論文寫作是一個很好的鍛煉。

3.2 胰島素使用中的問題

實驗取得了比較好的效果,但是也有很多問題需要在今后的教學中逐漸解決。首先是藥物的問題,在多種教材中均指出應使用pH2.5～3.5的酸性生理鹽水配制胰島素[3,5-6,12]，但在我們的預實驗中,使用此類胰島素注射后效果不如醫院購置的人胰島素注射液。也有文獻指出使用酸性生理鹽水并不能提高胰島素的活性[13],因此在課程上使用了后者。藥品說明中并沒有給出溶劑的pH值,也沒有除胰島素外其他成分的濃度,造成無法設置標準的對照組。在實驗中使用了正常的生理鹽水作為對照,這并不符合實驗設計的要求，因此課上會重點強調設置對照的規則,指出實驗中的生理鹽水只能作為部分對照。今后的實驗中可以考慮將胰島素溶液滅活后作為對照使用。

本次實驗使用胰島素的劑量與教材不符,教材中所用的劑量為每只小鼠2 IU,而我們通過預實驗確定的劑量是10 IU和40 IU,遠高于教材中的數值。從實驗結果可以看出,出現驚厥等嚴重反應的時間,最快為32 min,記錄的最晚出現時間是121 min，繼續延長時間可能有更多的小鼠出現驚厥反應。預實驗中注射各種劑量的胰島素后，4 h內沒有發生嚴重反應的小鼠,放置過夜后全部死亡,而未注射的小鼠全部存活。

大部分實驗教材都要求將注射胰島素的小鼠放于30～37 ℃下保溫[3-6]。但由于本實驗所用小鼠數量多,因此無法做到全部保溫,只能在室溫進行。這可能是所需胰島素劑量過大的原因之一。由于要進行統計比較,因此不能只考慮最快出現驚厥的情況。超過2 h才會發生的現象,不適合在總學時為4學時的實驗教學中進行觀察和統計。由結果可知,劑量越小出現驚厥的時間越晚,因此我們認為此次實驗的胰島素劑量選擇是比較合理的。

今后的改進方向可以包括進一步細化劑量分組,增加一個更低的劑量組。此外就是增加保溫和加熱,盡量提高小鼠所在位置的溫度,得到更好的實驗效果。

3.3 血糖測定的問題

本次實驗使用家用血糖儀測定小鼠血糖濃度,這個方式比較簡便,但準確性較差，并且其測定范圍是1.1～33.0 mM,在驚厥后測定的血糖濃度接近測量下限,準確度會更低。而注射葡萄糖后部分小鼠血糖濃度超上限,無法測定。雖然有這樣的問題,但這種方式還是值得采用。使用生化方法手動測定血糖濃度工作量過大,也不符合生理學實驗的教學目的。需要在教學中讓學生清楚測定準確度的情況,了解根據不同目的選擇不同實驗手段的理由。

3.4 對今后實驗教學的啟示

對于實驗的后續開展,可以設置更多的測量條件。例如本次實驗使用了空腹48 h的雌性小鼠,而教材中使用的都是空腹24 h的小鼠。也有研究顯示空腹12～24 h之間不影響胰島素的作用[13]，因此可以在實驗中增加空腹24 h組。也可以通過實驗證實其他條件的影響,例如比較雄性和雌性之間的區別,或者腹腔注射和皮下注射方式的不同。除了處理方式外,也可以研究藥物對低血糖休克發生的影響。這些都是可以增加的實驗條件。經過一段時間的積累,也可以在此基礎上啟發學生自行研究新的影響因素。這樣能夠培養學生設計實驗的能力,并且通過沒有明確結果的探索性研究,提高學生的學習興趣。

全班整體協作進行實驗以得到統計結果是本次實驗的特點,但由于數據來自多組,也出現很多問題,例如由于判斷標準不同,造成對時間的確定不一致，而學生注射操作的熟練度也有差別,有的組可能沒有完全注射進腹腔,或者損傷了內臟等,這些因素造成結果的不統一。在很多學生的實驗報告中也提出這一點,建議給出明確的可操作的標準,這也是今后實驗的改進方向之一。

4 結語

對胰島素休克實驗的改進可以使學生得到更全面的、貼近實際科研工作的訓練,對于擴展實驗課程功能、提高教學質量有重要意義,同時也能夠提高學生的學習興趣。這樣的改革對于生理學實驗這類傳統課程是非常必要的。

References)

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Improvement on experiment of insulin shock phenomenon

Zhou Chen, Bi Qun

(National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences， Peking University, Beijing 100871, China)

The insulin shock phenomenon is a simple observation experiment. In the fall semester of 2016, the physiological experiment course group of Peking University worked together and achieved the results and data that could be statistically analyzed by increasing the number of animals. The students not only completed the traditional observation of the phenomenon, but also

the training in the experimental design, animal grouping, statistical calculation, etc.

insulin shock; statistical analysis; physiological experiment

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.042

2017-01-10

國家自然科學基金基礎科學人才培養基金項目(J1310033)

周辰(1975—),男,江蘇無錫,博士,工程師,研究方向為神經生物學和電生理學.E-mail：zezhou@sina.com

G642.423；Q455

A

1002-4956(2017)08-0168-04