3種點樣方法對血清蛋白醋酸纖維膜電泳結果影響的對比研究

耿少輝 , 陳宇坤, 包 宇, 陳偉姣, 張穎茜, 王 蕾

(1. 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院, 河南 鄭州 450008;2. 河南中醫藥大學 藥學院, 河南 鄭州 450008)

3種點樣方法對血清蛋白醋酸纖維膜電泳結果影響的對比研究

耿少輝1, 陳宇坤1, 包 宇1, 陳偉姣1, 張穎茜1, 王 蕾2

(1. 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院, 河南 鄭州 450008;2. 河南中醫藥大學 藥學院, 河南 鄭州 450008)

研究用蓋玻片、濾紙和蓋玻片+擦鏡紙3種血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳點樣方法對電泳結果的影響,評價蓋玻片與擦鏡紙相結合的新型點樣方法在教學實驗中的應用效果,并分析3組的蛋白質相對含量有無差異。結果表明：在相同實驗條件下,蓋玻片+擦鏡紙組的電泳結果優于其他2種,3組的蛋白質相對含量無明顯差異；蓋玻片與擦鏡紙相結合的點樣方法較單純使用蓋玻片或濾紙的點樣方法點樣成功率有很大提高,出現的不良結果較少,能有效解決學生在電泳實驗操作中的點樣問題,可在教學實驗中推廣。

血清蛋白； 醋酸纖維薄膜； 電泳圖譜； 點樣方法

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗是生物化學實驗中最常開設的基本實驗之一[1-2]。電泳實驗步驟繁多,諸多因素可直接影響電泳所得蛋白質條帶結果的準確性和可重復性[3]。點樣作為其中的一個關鍵步驟,點樣的成功與否直接影響實驗結果[4]。點樣操作的失敗,一方面是因為點樣器的自身缺陷；另一方面同時也是主要方面是點樣人員的熟練度不夠[5]。故選用一種高效且簡單易操作的點樣方法十分必要。

經過長時間教學實踐與經驗總結,王蕾副教授發明了蓋玻片與擦鏡紙相結合的點樣方法,教學實踐效果較好。本文通過對比蓋玻片、濾紙和蓋玻片+擦鏡紙3種點樣方法對電泳結果的影響,評估3種點樣方法在教學實踐中的應用效果,以提供一種更加有效實用的醋酸纖維素薄膜電泳點樣方法。

1 材料

1.1 實驗器材

北京六一DYY-8C型電泳儀電源,DYCP-38C型臥式水平電泳槽,7200型分光光度計,醋酸纖維素薄膜(2 cm×8 cm),染液缸,漂洗缸,鑷子,濾紙,蓋玻片,擦鏡紙和培養皿等。

1.2 實驗試劑和材料

試劑:巴比妥緩沖液:pH8.6,本實驗用離子強度為0.07;染色液:氨基黑10B 0.5 g,溶于50 mL甲醇中,再加入冰醋酸10 mL,蒸餾水40 mL,混勻;漂洗液:冰醋酸5 mL,95%乙醇45 mL,蒸餾水50 mL,混勻;洗脫液:0.4 mol/L NaOH溶液[6]。

實驗材料:人血清。

2 方法

2.1 實驗前準備

在實驗課開始之前,將醋酸纖維素薄膜浸于盛有巴比妥緩沖液的培養皿中30 min左右,使其充分浸透,濕度均勻無白點[7],以便于學生操作。

2.2 實驗分組

隨機選取600名學習過基本實驗操作技能的中西醫臨床大二學生,學生以班級為單位平均分為3大組,分別采用蓋玻片、濾紙、蓋玻片+擦鏡紙點樣方法進行電泳操作。不告知學生3種同點樣方法對實驗結果的影響。

2.3 點樣

將完全浸透后的醋酸纖維素薄膜用鑷子輕輕取出,夾于濾紙中輕壓,吸去多余的溶液。

蓋玻片組:手持蓋玻片一端,使其蘸樣端與血清平面平行沒入血清樣品中,使血清均勻分布在蓋玻片點樣端后迅速取出，隨后將點樣端垂直印于薄膜上無光澤面一端2.0 cm處,動作迅速,力度適中[8]。

濾紙組:將濾紙剪成比醋酸纖維薄膜略窄的長條狀,從中間進行對折,使用對折端,與液面平行伸入血清樣品,蘸取適量血清,待濾紙折痕端沒入液面時迅速取出；將濾紙蘸有樣品的折痕端垂直印于薄膜上無光澤一端約2.0cm處,動作迅速,力度適中[8]。

蓋玻片+擦鏡紙組:將擦鏡紙剪成長約10 cm寬為4 cm的長條狀,將蓋玻片放置于擦鏡紙中間,使擦鏡紙完全包裹蓋玻片一端；將點樣端與血清樣品液面平行伸入蘸取樣品,迅速取出；將點樣端垂直印于薄膜無光澤面的一端2.0 cm處,動作要迅速,力度要適中[8]。

2.4 電泳

待血清滲入薄膜后,以點樣的無光澤面向下,薄膜兩端放于電泳槽支架的紗布鹽橋上,點樣端放于電泳槽的負極,薄膜緊貼紗布并繃直。電泳槽同時放置的膜片之間互相間隔一小段距離,蓋上電泳槽的蓋子,接通電源進行電泳。室溫下調節電壓至110～140 V,電流約0.4～0.6 mA/cm,通電時間夏季為40～50 min,冬季為60 min左右[9]。本實驗在冬季,通電60 min。

2.5 染色及漂洗

關閉電源后立即將薄膜取出,放入染色液中浸染3～5 min；然后依次移入放有漂洗液的3個培養皿中漂洗數次,至蛋白質條帶清晰,背景無色為止；將電泳條帶放在濾紙上,吸去多余的溶液,自然風干。

2.6 數據記錄及定量

記錄3種點樣方法電泳結果的成功次數與失敗次數,以及出現不良結果的次數。對比3種點樣方法所得電泳條帶的寬度與顏色。分別取3組中效果較好的電泳條帶各6條，將蛋白質條帶與一條空白帶分別剪開,裝入6支試管中,各管中加入0.4 mol/L NaOH溶液4 mL,振搖數次,使顏料色澤浸出。30 min后,使用7200型分光光度計在650 nm波長下進行比色,測各組分蛋白百分含量。

2.7 統計學分析

采用SPSS17.0軟件對所得數據進行統計學分析:3組電泳成功率與出現不良結果的次數采用卡方檢驗進行數據分析；3組血清蛋白相對含量比較時采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 實驗成功率對比

以電泳所得蛋白質條帶中5條蛋白質條帶清晰可見、易于辨識、圖譜整齊、無拖尾或過于緊密為依據作為成功的標準[10]。3種點樣方法所對應成功率的具體結果見表1。由表1可以看出：濾紙組的實驗成功率比蓋玻片組高,P<0.01；蓋玻片+擦鏡紙組成功率為90.5%與濾紙組的72.0%相比,P<0.01,具有統計學意義。對比可得,3種點樣方法中采用蓋玻片+擦鏡紙相結合的方式進行點樣在提高實驗成功率方面具有最好的效果。

表1 3種點樣方法實驗成功率對比

注：與蓋玻片組相比,△：P<0.01；與“濾紙”組相比,▲：P<0.01

3.2 不良結果出現次數對比

記錄所得的每組出現不良結果——拖尾、電泳圖譜不整齊、蛋白條帶分離不清的次數的結果見表2。表2表明：在出現拖尾與蛋白條帶分離不清的不良結果的次數上,濾紙組與蓋玻片組差異不明顯,P>0.05,蓋玻片+擦鏡紙組出現次數較少,P<0.01；電泳圖譜不整齊這一不良結果出現的次數上,濾紙組與蓋玻片+擦鏡紙組差異不明顯,P>0.05,兩組均比蓋玻片組的次數明顯減少,P<0.01。以上結果說明,使用濾紙進行點樣與使用蓋玻片點樣相比可以減少電泳圖譜不整齊這一不良結果的出現,但在拖尾和蛋白條帶分離不清出現的次數上效果不明顯。使用改進后的蓋玻片+擦鏡紙結合的方法進行點樣與單獨使用蓋玻片相比可以有效減少拖尾、電泳圖譜不整齊、蛋白條帶分離不清3種不良結果的出現。3種點樣方法中蓋玻片+擦鏡紙的點樣方法在減少不良結果出現次數上效果最好。

表2 3種點樣方法不良結果出現次數對比

注：與蓋玻片組相比,△：P<0.01；與濾紙組相比,▲：P<0.01

3.3 電泳條帶寬度與顏色深淺對比

3種點樣方法均可獲得5條清晰蛋白條帶,但蛋白條帶寬度與顏色深淺略有差異,3種點樣方法所得的具有代表性的電泳條帶見圖1。由圖1對比可知：蓋玻片組蛋白條帶最窄,顏色也最淺；濾紙組蛋白條帶最寬,顏色也最深；蓋玻片+擦鏡紙組顏色與寬度介于兩者之間。蓋玻片+擦鏡紙組各蛋白條帶寬度均勻、顏色適中、易于辨識。

圖1 電泳圖譜

3.4 各組分蛋白質相對含量對比

3種點樣方法都證明了血清中各組分蛋白的相對含量排序:清蛋白>γ球蛋白>β球蛋白>α2-球蛋白>α1-球蛋白,即清蛋白占總蛋白比例最大,α1-球蛋白總蛋白比例最小[11]。使用分光光度計測得的3種點樣方法各組分蛋白質相對含量(每種方法測6次,每組的平均值)見表3。采用單因素方差分析,3種點樣方法在分離各組分蛋白含量方面差異沒有顯著性。

表3 3種點樣方法各組分蛋白質相對含量對比 %

4 討論

電泳實驗在實驗教學與科研中應用廣泛,點樣是電泳實驗的關鍵一步,點樣的成功與否直接影響著電泳的結果[4],選擇高效且簡單實用的點樣方法來提高學生的點樣成功率是十分必要的。

采用蓋玻片進行點樣會因為蓋玻片端面不整齊,容易導致蘸取的樣品量在蓋玻片端分布不均勻,從而出現拖尾、電泳圖譜不整齊或蛋白條帶分離不清等不良結果[12],點樣成功率較低。選用濾紙進行點樣,可以通過濾紙的吸水性來解決蓋玻片點樣不均的問題,故電泳圖譜不整齊出現的次數較使用蓋玻片點樣有所減少；但因濾紙吸水性好[13-14],容易蘸取過多的樣品量,拖尾與蛋白條帶分離不清的問題得不到解決。選用蓋玻片+擦鏡紙相結合的方法進行點樣,因為擦鏡紙的吸水性較濾紙低,蓋玻片又能起到支撐作用,故能有效解決點樣不均勻、點樣量不易控制的問題，因此能夠減少不良結果的出現,顯著提高點樣成功率。

電泳條帶中各蛋白組分的寬度與顏色深淺主要與蛋白質的含量有關[15]。所蘸取的樣品量越多,條帶整體顏色越深,各組分蛋白條帶也越寬。選用濾紙進行點樣,因其吸水性較好,會蘸取較多的樣品量,故蛋白條帶整體顏色最深,各組分蛋白條帶最寬。蓋玻片因其點樣面不整齊,蘸取的樣品量多少不均勻,導致整體點樣量偏少,顏色偏淺。選用蓋玻片+擦鏡紙進行點樣,因為擦鏡紙吸取的樣品量小于濾紙而大于蓋玻片,故條帶顏色與各組分寬度介于二者之間。

綜上所述,在相同且適宜的實驗條件下,選用蓋玻片+擦鏡紙相結合的點樣方法與單純使用蓋玻片或濾紙的點樣方法相比,具有成功率高、不良結果出現次數少、條帶顏色清楚易辨識等優點,能有效改善電泳效果。此外該方法操作簡單、易于重復,是一種十分適合學生的點樣方法。又因其原料易于獲得,成本低,能源耗費少,是一種較為理想的醋酸纖維薄膜電泳點樣方法,可在生化實驗教學或科學實驗中推廣。

致謝:本文承蒙河南中醫藥大學基礎醫學院裴蘭英老師與第一臨床醫學院李江波同學在文章修改與數據分析方面提供的幫助,《中醫學報》主編程延安老師在圖表方面提供的幫助,藥學院武慧敏老師在選題方面提出的寶貴意見,特此致謝！

References)

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Comparative study of effect of 3 spotting methods on results of serum protein acetate membrane electrophoresis

Geng Shaohui1, Chen Yukun1, Bao Yu1, Chen Weijiao1, Zhang Yingqian1, Wang Lei2

(1. First Clinical Medical College, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China;2. College of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China)

The effect of the serum protein acetate membrane electrophoresis by the three spotting methods of the coverslip, filter paper and coverslip+lens cleaning paper on the electrophoresis results is studied. The application effect of the new spotting method with the combination of the coverslip and the lens cleaning paper is evaluated and the difference of relative protein content of the three groups is analyzed. The results show that under the same experimental conditions, the electrophoresis result of coverslip+lens cleaning paper group is better than that of the other 2 groups, and there is no significant difference in the protein relative content of the 3 groups. The spotting method with the combination of the coverslip with the lens cleaning paper is better than the spotting methods of the coverslip and the filter paper, which greatly improves the successful rate. It can effectively solve the students’ spotting problem in the operation of electrophoresis experiments, and can be popularized in the teaching experiment.

serum protein; acetate membrane; electrophoregram; spotting method

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.016

2017-02-24

河南省教育科學十二五規劃課題(2014-JKGHC-0100)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201610471013)

耿少輝(1997—),男,河南安陽,本科生,專業方向為中西醫臨床E-mail：shaohuigeng2016@163.com

王蕾(1963—),女,河南許昌,本科,副教授,主要從事生物化學與分子生物學教學與研究.E-mail：wangl131@sina.com

R446.1

B

1002-4956(2017)08-0060-03