水樣中大腸菌數(shù)定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

付小花, 張 嫻, 樂毅全, 唐賢春, 王 磊

(1. 同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200092;2. 同濟(jì)大學(xué) 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092)

水樣中大腸菌數(shù)定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

付小花1,2, 張 嫻1,2, 樂毅全1,2, 唐賢春1,2, 王 磊1,2

(1. 同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200092;2. 同濟(jì)大學(xué) 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092)

為不斷完善環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程建設(shè),培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)際樣品分析能力,設(shè)計(jì)了一套檢測水樣中大腸菌數(shù)的實(shí)時熒光定量PCR(pdymerase chain reaction)實(shí)驗(yàn)。教學(xué)實(shí)踐表明,實(shí)驗(yàn)方案切實(shí)可行,學(xué)生完成情況良好,學(xué)生了解并踐行了實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測環(huán)境樣品中的大腸菌數(shù)的方法,切身體會到新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的簡便性與靈敏性,提升了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣與創(chuàng)新能力。

環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn); 實(shí)時熒光定量PCR; 大腸菌數(shù)

大腸菌數(shù)常被用來作為水體受糞便污染情況的指標(biāo)。大腸菌數(shù)的傳統(tǒng)檢測方法主要是多管發(fā)酵法和濾膜法[1]。環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)是我院環(huán)境工程、市政工程和環(huán)境科學(xué)專業(yè)本科生的必修專業(yè)課,實(shí)驗(yàn)教學(xué)中采用多管發(fā)酵法檢測水樣中大腸菌數(shù),具體是將水樣進(jìn)行系列梯度稀釋,分別接種到含有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中,37 ℃培養(yǎng) 24 h,觀察產(chǎn)酸、產(chǎn)氣情況,陽性樣本的確定需要進(jìn)一步的定性實(shí)驗(yàn),此法檢測樣品的優(yōu)勢是儀器設(shè)備簡單,缺點(diǎn)是費(fèi)時費(fèi)力。

實(shí)時熒光定量PCR(pdymerase chain reaction)技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該方法具有快速、靈敏、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),近年來在水體中的腸道病原菌定量檢測中被廣泛使用[2-3]。Sharma 和Dean-Nystrom 建立了定量PCR檢測產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的方法[4],張崇淼等人建立了水環(huán)境中多種腸道病毒的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法[5]。 為豐富實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容,進(jìn)一步加強(qiáng)和完善學(xué)科建設(shè),在環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引入定量PCR技術(shù)。

1 主要儀器

定量PCR儀(ABI 7500),臺式高速離心機(jī)(Thermo Hearus Pico17),單道可調(diào)微量移液器(Gilson),PCR儀(ABI Veritti 96 well),超微量紫外/可見分光光度計(jì)(NanoDrop2000),恒溫?fù)u床,隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

2 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)定

2.1 定量方法及定量引物的選擇

實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)定量方法的不同分為絕對定量和相對定量,絕對定量是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目,通常用拷貝數(shù)表示；相對定量是測定目的基因在2個或多個樣本中的含量的相對比例,但并不知道它們在每個樣本中的實(shí)際拷貝數(shù)。對于樣品中的大腸菌群需要知道的是樣品中大腸菌群的絕對數(shù)量,所以選擇使用絕對定量法檢測。絕對定量實(shí)驗(yàn)需要已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品,需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)時熒光定量PCR根據(jù)定量檢測方法的不同分為探針法和染料法。探針需要公司合成,相對而言成本較高,而且探針設(shè)計(jì)困難。染料法對DNA模板沒有選擇性，使用方便，靈敏度高，價格便宜，適用性廣,實(shí)驗(yàn)教學(xué)選用這種方法較為合適。目前定量PCR中主要使用的染料是SYBR Green I,SYBR Green I 是一種可以與所有雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合的具有綠色激發(fā)波長的染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合后,熒光信號增強(qiáng)為原來的20倍以上；雙鏈DNA解鏈時,染料從DNA上釋放出來,熒光信號急劇減弱[6],熒光信號的強(qiáng)度與雙鏈DNA分子數(shù)量相關(guān),因此根據(jù)延伸后的熒光強(qiáng)度可以實(shí)時監(jiān)測PCR的進(jìn)程。

由于SYBR Green I 可以與所有的雙鏈DNA分子結(jié)合,所以反應(yīng)中若存在目的片段以外的雙鏈DNA,比如非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體等,會對定量的結(jié)果產(chǎn)生影響,產(chǎn)生假陽性或使定量結(jié)果偏高[7]。選擇合適的引物,盡量避免非特異性擴(kuò)增和引物二聚體對SYBR Green I 法的定量準(zhǔn)確性非常重要。通過文獻(xiàn)閱讀和實(shí)驗(yàn)比較,選擇擴(kuò)增大腸菌群的fepE基因的引物[8],具體序列為E1: 5′-TGTTCAGTGGCAAGAGTT-3′ 和E2: 5′-TAATCGATATACCCGCTC-3′, 目的產(chǎn)物大小為353bp。

2.2 水樣采集與DNA提取

用采樣器采集校園河水,考慮到定量PCR測定的大腸菌群數(shù)據(jù)要與多管發(fā)酵的結(jié)果相比較,因而采樣時間、地點(diǎn)與多管發(fā)酵樣品的時間、地點(diǎn)相同。采集的河水樣品,立即用0.22 μm濾膜加壓過濾,將微生物截留在濾膜上,然后用Mo Bio公司的Ultra clean soil Kit試劑盒提取DNA,濾膜剪碎放入研磨管中,按操作說明提取DNA。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品可以使用已知拷貝數(shù)的基因組、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒,研究表明質(zhì)粒穩(wěn)定性好,經(jīng)反復(fù)凍融或長時間儲存,不易降解,穩(wěn)定性優(yōu)于基因組DNA或PCR產(chǎn)物[9]。學(xué)生實(shí)驗(yàn)課時間較長,標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性好有利于教師的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作；并且質(zhì)粒提取方便,產(chǎn)量高,易于儲存,這將大大減少實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作,因此選用質(zhì)粒作為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。

用 E1和E2擴(kuò)增大腸桿菌Top10菌株DNA,電泳圖見圖1。從圖中可以看出E1和E2擴(kuò)增產(chǎn)物大小約350左右,與目的片段大小一致,條帶清晰,無其他雜帶,無模板對照沒有特異性條帶,說明PCR擴(kuò)增成功。PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含60 mg/L氨芐青霉素的LB固體平板上,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板隨機(jī)挑取7個單菌落于含60 mg/L氨芐青霉素的LB液體中培養(yǎng)4～6 h,M13引物(M13F:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13R: 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ ) PCR鑒定轉(zhuǎn)化子(見圖2)。從圖2中可以看出,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與插入片段大小一致,說明這些轉(zhuǎn)化子中均插入了目的片段。選擇條帶大小與目的片段大小一致的轉(zhuǎn)化子測序,測序結(jié)果去除載體序列后,在NCBI網(wǎng)站上用BLAST比對,比對正確的轉(zhuǎn)化子菌種保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 E1和E2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 轉(zhuǎn)化子鑒定瓊脂糖電泳圖

將比對結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子菌液20 μL接入含60 mg/L氨芐青霉素的3 mL液體LB培養(yǎng)基的無菌試管中,37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,用AXYGEN質(zhì)粒小抽試劑盒按操作說明提取質(zhì)粒,用NanoDrop2000測定質(zhì)粒濃度,并根據(jù)下式換算為拷貝數(shù)濃度[10]：

(1)

經(jīng)計(jì)算,提取的質(zhì)粒濃度為3.1×1010copy/μL。

2.4 反應(yīng)體系與實(shí)驗(yàn)程序的確定

為了節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi),并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,采用20 μL PCR反應(yīng)體系,其中含有滅菌水8 μL,上下

游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板2 μL,SYBR Mix (2×)10 μL。為了保證擴(kuò)增效率,實(shí)驗(yàn)采用三步法,具體程序?yàn)?5 ℃、5 min(預(yù)變性),95 ℃、15 s,55℃、30 s,72℃、34 s(采集熒光信號),40個循環(huán),融解曲線分析 60～95 ℃。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將上述已知濃度的質(zhì)粒先稀釋為1010copy/μL,再按10倍稀釋,以濃度為102～108copy/μL的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品,制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線：基線平整,相關(guān)系數(shù)有R2≥0.98,擴(kuò)增效率在0.9～1.1之間,越接近于1越好[11]。圖3(a)是E1和E2定量大腸菌群的擴(kuò)增曲線(ΔRn為樣品熒光信號值與空白對照的差值),從曲線中可以看出,標(biāo)線的基線平整,指數(shù)范圍大,平臺期匯于一起。圖3(b)為標(biāo)準(zhǔn)曲線,由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到擴(kuò)增效率為93.941%,R2=0.999,符合理想標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求,結(jié)合融解曲線分析知定量準(zhǔn)確。

圖3 定量大腸菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 教學(xué)實(shí)踐

3.1 教學(xué)實(shí)踐的開展

由實(shí)驗(yàn)教師帶領(lǐng)部分學(xué)生準(zhǔn)備如下實(shí)驗(yàn)材料：107copy/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,水樣總DNA濃度為10 μmol/L的引物E1和E2,SYBR mix,無菌水,無菌離心管(1.5 mL,0.2 mL),無菌Tip頭,一次性手套,0.2 mL的光學(xué)PCR管等。學(xué)生2人一組,每組一套實(shí)驗(yàn)用品(上述材料和一套單道可調(diào)微量移液器)。

實(shí)驗(yàn)開始前,教師先對定量PCR原理及操作過程作簡單介紹,詳細(xì)講解實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng),如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,操作中為了保持平行樣之間完全平行的兩次擴(kuò)增體系的分裝等。實(shí)驗(yàn)中以學(xué)生自主操作,教師巡視指導(dǎo)為主要教學(xué)方法。PCR體系配制完成后,指導(dǎo)學(xué)生將樣品放入定量PCR儀,并進(jìn)行軟件編程,待儀器運(yùn)行結(jié)束,指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行結(jié)果分析，并引導(dǎo)學(xué)生查詢資料,了解實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的各種問題的成因。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合全班的結(jié)果看,實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚可:從融解曲線知操作過程幾乎沒有引入污染物,多數(shù)組別的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。水樣中大腸菌數(shù)定量結(jié)果全班平均為8 500 copy/L,同樣的樣品,多管發(fā)酵法測得的大腸桿菌數(shù)為2 300 個/L,PCR的定量結(jié)果比多管發(fā)酵結(jié)果高,定量結(jié)果可能有高估的情況,但這只是一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,要多次實(shí)驗(yàn)后才能下結(jié)論。

3.3 教學(xué)效果評估

該實(shí)驗(yàn)為探索性綜合實(shí)驗(yàn),以本科生為主體,從課程建設(shè)和本科生培養(yǎng)的角度考慮,此實(shí)驗(yàn)教學(xué)是成功的,不僅豐富了本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容,還培養(yǎng)了學(xué)生的監(jiān)測能力。實(shí)驗(yàn)中,學(xué)生了解并踐行了現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測環(huán)境微生物,切身體會到新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的簡便性與靈敏性。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析及資料查詢、實(shí)驗(yàn)報告撰寫等,使學(xué)生得到系統(tǒng)鍛煉,培養(yǎng)了學(xué)生的獨(dú)立思考能力、實(shí)驗(yàn)操作能力和分析能力[12]，充分調(diào)動了學(xué)生的積極性,有利于學(xué)生樹立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維和態(tài)度,提升其創(chuàng)新能力。

4 結(jié)語

環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門實(shí)踐性和應(yīng)用性很強(qiáng)的課程。通過實(shí)驗(yàn)教學(xué),培養(yǎng)學(xué)生探索精神和實(shí)踐能力。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和學(xué)科建設(shè)的要求,對實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容適當(dāng)調(diào)整,以滿足創(chuàng)新人才的培養(yǎng)需求,是實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)的重要內(nèi)容。本文從教學(xué)實(shí)驗(yàn)角度考慮,設(shè)計(jì)了用于檢測大腸菌數(shù)的定量PCR實(shí)驗(yàn),使學(xué)生有機(jī)會在實(shí)驗(yàn)課堂上學(xué)習(xí)熒光定量操作技術(shù),開拓了學(xué)生的視野,激發(fā)了學(xué)生對環(huán)境微生物學(xué)的學(xué)習(xí)興趣,提升了學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)和科研的積極性和主動性,取得了良好的教學(xué)效果。

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Design of experiment for quantitative PCR detection of coliform bacteria number in water sample

Fu Xiaohua1,2, Zhang Xian1,2, Le Yiquan1,2, Tang Xianchun1,2, Wang Lei1,2

(1. School of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China;2. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China)

In order to continuously improve the construction of Environmental Microbiology Experiment course and cultivate the students’ ability to analyze the actual samples, an experimental system is designed for a real-time fluorescence quantitative PCR (pdymerase chain reaction) detection of the coliform bacteria number in the water sample. The teaching practice shows that the experimental scheme is feasible, and the students carry out the experiment well. They acquire the knowledge about the coilform bacteria in the environmental samples detected by the real-time fluorescent quantitative PCR technology, and experience the simplicity and sensitivity of the new experimental technology by themselves, which can improve their learning interest and innovative ability.

environmental microbiology experiment； real-time fluorescent quantitative PCR； coliform bacteria number

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.015

2017-02-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21577101)；同濟(jì)大學(xué)第十一期實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革項(xiàng)目

付小花(1978—),女,安徽定遠(yuǎn),碩士,助理研究員,主要從事分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)及環(huán)境微生物相關(guān)研究工作.E-mail：xiaohuafu@tongji.edu.cn

X832;G642.423

A

1002-4956(2017)08-0056-04