光響應茶皂苷元納米膠囊的制備及其抗菌活性研究綜合實驗

劉華鼐, 楊 謙, 葉 勇

(華南理工大學 化學與化工學院, 廣東 廣州 510640)

光響應茶皂苷元納米膠囊的制備及其抗菌活性研究綜合實驗

劉華鼐, 楊 謙, 葉 勇

(華南理工大學 化學與化工學院, 廣東 廣州 510640)

介紹了以科研為導向,設計和開設的“光響應茶皂苷元納米膠囊的制備及其抗菌活性研究”研究性綜合實驗。通過本實驗,學生體驗了查閱文獻、了解實驗原理、確立研究思路和策略、制備產品、表征性能、處理數據、分析討論、撰寫實驗報告等完整的科研過程,掌握了天然產物的水解和提純、納米膠囊的制備、物質的化學反應性質、光譜表征、抗菌活性研究等相關知識。實踐表明,本實驗選題針對性強,有助于提高學生學習的積極性、主動性和綜合實驗技能,有利于培養學生的創新意識和科學精神。

納米膠囊； 研究性綜合實驗； 茶皂苷元； 抗菌活性

實施大學生科研訓練計劃是國家“本科教學工程”的重要組成部分。其首要內容就是以科研訓練為切入點,加強學生創新精神的培育[1]。開設研究性綜合實驗的目的就是要提高學生融會貫通地運用所學相關課程的知識的能力,培養學生的創新意識和科學精神。實踐表明研究性綜合實驗有利于激勵學生的求知愿望,有利于學生理論聯系實際,有利于提高學生的實驗技能和科研意識[2]。

1 研究性綜合實驗設計思路

在實驗設計和實踐中貫徹以科研為導向的指導思想。以科研為導向的內涵首先是實驗內容源于教師的科研成果,以體現教學內容的科學性、前沿性和開放性；其次是實驗教學過程以科研的思路、流程為導向,學生在2～3周的自主實驗中經歷科研的全過程訓練。在具體實踐環節中采用“以問題為基礎的學習” (problem based learning,簡稱PBL)的研究性教學方法。該方法已經成為發達國家推崇的教學改革方法[3-5]。PBL研究性教學法的關鍵是教師要以學生為中心,根據教學目的和學生的具體情況精心設計出具有高度科學性、合理性、開放性和可行性的題目,讓學生由被動學習轉變為主動學習。

藥物開發涉及原料藥制備及質量監控、成品藥制備及質量監控、成品制劑的應用效果等相關聯的環節。在實驗設計中提出各環節需解決的問題及相應的解決方案或任務選項(如圖1所示)。每個環節都具有開放性,學生可通過查閱資料自行設計多個可行的方案。實驗教學過程的安排和目標大體如圖2所示。內容涉及文獻調研、原理討論、原料準備、方案預研、原料藥和成品藥的制備、性能表征、撰寫報告、成果展示等,模擬科研的全過程,以達到科研訓練的目的。

圖1 研究性綜合實驗的設計思路

在大量教學和科研成果的基礎上,我們設計了“光響應茶皂苷元納米膠囊的制備及其抗菌活性研究”。茶皂苷具有優良的表面活性功能,還具有消炎、鎮痛、抗癌、殺菌等藥理作用,具有很大的開發價值。但茶皂苷產品目前均為粗品,關于其納米膠囊的研究也鮮見[6]。納米膠囊具有很強的靶向作用[7-8],將光響應技術引入納米膠囊的制備過程,可使納米膠囊的形態、穩定性和釋放受光控制[6]。該實驗涉及了茶皂苷的水解和純化、納米膠囊的制備、性質分析、物相表征、光譜分析、性能檢測、抗菌活性等內容,體現了化學、藥學、光學、生物學、材料學等學科中的重要知識點的交叉融合。不僅適用于制藥工程,也適用于化學、生物學等專業,甚至可以推廣至材料學等專業,是一項新穎適用范圍廣泛的研究性綜合實驗。

圖2 實驗進程安排和目的

2 實驗原理

茶皂苷,又稱茶皂素,屬于三萜類皂角苷,為白色微細柱狀晶體,易溶于含水甲醇、含水乙醇、冰醋酸、吡啶等,熔點為223～224 ℃。其糖體部分和萘酚反應可以生成紫色物質。苷鍵容易被酸、堿和酶水解生成糖與皂苷元[9]。茶皂苷元具有比茶皂苷易純化的性質,結構簡單,易溶于含水甲醇和含水乙醇。茶皂苷的活性部位主要在于苯皂苷元上。

光響應納米的原理是基于光敏化合物的作用。脫鎂葉綠酸因其較強的光敏化特性,常被用于光敏治療[10],但脫鎂葉綠酸α在紅光激發下產生單線態氧,破壞磷脂鍵而造成納米囊的滲漏。大豆卵磷脂具有良好的生物相容性、生物可降解性、安全無毒、良好的成囊和成膜的性能、成本低等優點。本實驗采用大豆卵磷脂結合膽固醇為囊材,可以很好地對茶皂苷元進行包封,獲得光響應茶皂苷元納米膠囊(photoresponse theasapogenol nanocapsules, 簡稱PTN)。

3 實驗

3.1 試劑與儀器

試劑:油茶皂素、脫鎂葉綠酸α、大豆卵磷脂、膽固醇、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、醋酐、氯仿、二氯甲烷、α-萘酚醇、濃鹽酸、濃硫酸、KOH、光譜級溴化鉀、氯化鋇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、MH肉湯、大腸桿菌菌液、金黃色葡糖球菌菌液、去離子水。

儀器:磁力攪拌器、圓底燒瓶、電子天平、旋轉蒸發儀、循環水真空泵、離心機、超聲波清洗器、真空干燥箱、高壓滅菌鍋、紅光發射器、恒溫振蕩器、無菌操作臺、移液槍；pH酸度計、0.22 μm水相針式過濾器(聚醚砜)、熔點測定儀、粒度分析儀、紫外分光光度計、傅里葉紅外光譜儀。

3.2 油茶皂苷的水解

3.2.1 油茶皂苷酸水解

稱取油茶皂苷50 g于圓底燒瓶中,加入500 mL鹽酸甲醇溶液(濃鹽酸100 mL、甲醇300 mL、水100 mL),在80 ℃熱水浴中回流反應5 h;然后將反應液趁熱過濾,濾液減壓旋轉蒸發回收甲醇;再將反應液倒入大量去離子水中,有棕色沉淀析出,離心并多次用水洗滌沉淀至洗液無色;將沉淀置于真空干燥箱70 ℃下烘干得茶皂苷元的酸水解產品。

3.2.2 油茶皂苷堿水解

準確稱取酸水解產品10 g,溶于150 mL的甲醇-水(體積比為3∶1)溶液中,加入KOH固體6 g；在90 ℃的熱水浴中回流反應4 h,得到棕色皂化溶液;趁熱過濾,將濾液減壓回流,回收甲醇;然后將反應液倒入大量去離子水中,有沉淀析出,離心分離即得沉淀,多次用水洗滌沉淀至洗液無色;將沉淀置于真空干燥箱70 ℃下烘干得茶皂苷元粗品(水解產品)。

3.2.3 茶皂苷水解產品的純化

將堿水解產品用乙酸乙酯溶解,抽濾,減壓旋蒸回收乙酸乙酯,得固體,并置于通風櫥中揮發完全,得到淺黃色茶皂苷元粉末;加無水乙醇溶解,再加入適量的蒸餾水,滴加幾滴濃鹽酸,出現乳白色沉淀,離心分離;將沉淀置于真空干燥箱中于45 ℃烘干,得到純化茶皂苷元。

3.3 光響應茶皂苷元納米膠囊的制備

稱取0.5 g大豆卵磷脂、0.1 g膽固醇和1 mg脫鎂葉綠酸α,加入10 mL氯仿超聲溶解,得到油相；稱取茶皂苷元0.025 g溶解或懸浮于5 mL 0.1mol/L、pH=7.4的磷酸緩沖液中,得到水相；將水相滴加到上述油相中,在600 r/min下攪拌,溶劑揮發,待水性脂質體形成,即得W/O型乳液；移取5 mL、0.1 mol/L、pH=7.4的磷酸緩沖液加入上述W/O型乳液中,在600 r/min下攪拌,直至無脂質體團塊,形成脂質體,即為W/O/W型乳液；將得到的乳液在30 ℃下旋轉蒸發2 h，以去除氯仿；然后轉移到真空干燥器抽濾1 h,得到的脂質體水浴超聲30 min,過水相針式過濾器,得到的脂質體即茶皂苷元納米膠囊保存在2～8 ℃下。

3.4 光響應茶皂苷元納米膠囊的抗菌活性

3.4.1 MH肉湯培養基的配制及滅菌

稱取1.05 g的MH肉湯固體于50 mL帶塞錐形瓶中,加蒸餾水至50 mL,攪拌至MH肉湯固體完全溶解,塞緊瓶塞；高壓滅菌鍋的壓力維持在0.1 MPa至0.15 MPa,加熱滅菌20 min。滅菌完成后將滅菌后物品轉移到超凈臺。

3.4.2 菌種活化

取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌原液各500 μL,分別轉接到10 mL滅菌的肉湯液體培基,在37 ℃下培養24 h,連續培養2代,放入冰箱備用。

3.4.3 抑菌實驗

(1) 菌懸液稀釋倍數的確定:取兩支相同試管,一根加入4～6 mL配制好的硫酸鋇懸液(0.5麥氏比濁管),另一根加入1 mL活化菌懸液,加入MH肉湯稀釋菌懸液,當濁度與0.5麥氏比濁度相同時,即為抑菌實驗需要將培養好的菌懸液稀釋的倍數。

(2) 藥物貯存液配制:量取適量的光響應茶皂苷元納米膠囊、茶皂苷元膠囊、空白囊配制成128 g/L的貯存液,過濾滅菌后備用。

(3) 菌懸液的配置:在滅菌過的500 mL燒杯里用移液槍加入100 μL初培養的菌懸液,按照稀釋倍數加入MH肉湯稀釋,再將稀釋好的菌懸液進行1∶100稀釋后備用。

(4) 抗菌活性測定采用肉湯連續稀釋法。取9支試管,另取一支同樣的試管,標記上“CK”。除第一支試管外,每支試管內加MH肉湯 2 mL；然后用MH肉湯稀釋擬測的藥物原液至擬測的最高質量濃度,即128g /L,分別在第一和第二支試管中加入2 mL;第二管混勻后吸出2 mL加到第三管中,依次對倍稀釋到第9,吸去2 mL棄去。這樣各管皂苷的最終質量濃度依次為 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0. 5 g /L 。將接種好菌懸液的稀釋管塞好棉塞,置37 ℃恒溫振蕩器中孵育12 h。其中光響應茶皂苷元納米膠囊紅光光照12 h和無光照12 h為實驗組,茶皂苷元納米膠囊無光照12 h為陰性對照組,空白納米膠囊為空白對照組。

3.5 顯色反應和表征

用Molish反應和Libermann Burchard反應對油茶皂苷和茶皂苷元進行定性分析。用美國Stanford公司的Optimelt熔點儀測定油茶皂苷和茶皂苷元的熔點。用優尼克(上海)儀器有限公司的UV-2800紫外可見分光光度計測試茶皂苷元的紫外光譜(茶皂苷元0.5 g/L的乙醇溶液)。用美國Thermo electron corporation 公司的Nicolet 380 FT-IR傅里葉變換紅外光譜分光光度計測試茶皂苷元的紅外光譜。用英國Malven儀器有限公司的ZS Nano S型馬爾文納米粒度分析儀測定脂質體的粒徑和Zeta電位,水為分散相,25 ℃,吸光度為0.01,相對折光指數為1.330。

4 實驗結果與討論

4.1 茶皂苷元的制備和分析

4.1.1 顯色反應

油茶皂苷經過酸水解、堿水解和純化后得到白色的茶皂苷元。向水解溶液中加入2～3滴10% α-萘酚醇溶液,振蕩后斜置試管,沿管壁滴加1 mL濃硫酸溶液,靜置,發現液面交界處紫色環出現(見圖3(a))。Molish反應結果表明茶皂苷中含有糖,而苷元中不含糖。因為糖在濃硫酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復合物,在糖液和濃硫酸的液面間形成紫環。說明茶皂苷水解為茶皂苷元和糖[8]。Libermann Burchard反應中,取茶皂苷元粉末樣品5 mg,加入3 mL醋酐充分溶解,滴加1滴濃硫酸,充分搖勻后,顏色由淺黃色,經過橙色,最終呈紅色(見圖3(b)),表明茶皂苷元為三萜類皂苷。

圖3 顯色反應

4.1.2 紫外吸收光譜

茶皂苷元的紫外光譜如圖4所示,最大吸收峰位于230 nm處,為皂苷元的吸收峰；272 nm處的弱峰為雜質黃酮苷類化合物的吸收峰[11]。

4.1.3 紅外光譜圖

茶皂苷元的紅外光譜見圖5,3386 cm-1為νOH伸縮振動,表明分子中有多個—OH。2 924 cm-1、2 852 cm-1處表明分子中存在 CH2、CH3等基團。 1 717 cm-1、2 845 cm-1處表明分子中存在—CHO,1 240 cm-1、1 377 cm-1處表明為齊敦果酸型化合物。 1 451～1 620 cm-1之間的峰為苯環骨架,650～1 035 cm-1為分子苯環取代中的 CH振動 。結合熔點251.1～252.7 ℃,確定該苷元為3α, 16α, 21β, 22α, 28- 五羥基-4β—CHO齊敦果烯[12]。

圖4 茶皂苷元的紫外光譜

圖5 茶皂苷元的紅外光譜

4.2 納米膠囊的粒徑分布及性能測定

脂質體是由一種排列有序的脂質雙分子層組成的多層微囊,具有類似生物膜雙分子層的近晶型液晶結構,大小通常為幾十納米到幾十微米。按結構和粒徑特點可將脂質體分為小單室脂質體(10～200 nm)、大單室脂質體(0.2～1 μm)和多室脂質體(1～5 μm)。在體內,無論通過何種給藥途徑,納米給藥系統都要經歷跨越極性上皮細胞的過程,上皮細胞所構成的細胞單層一般是納米載體能否順利到達靶部位的第一道屏障[13]。粒子在100 nm內具有高透膜性,100～200 nm內具有較高的透膜性。納米粒的透膜性隨其粒徑的增加而減少,被動轉運透膜的粒徑臨界值為500 nm,大于500 nm的粒子很難跨越上皮細胞進入循環系統[14]。圖6為光響應茶皂苷元納米膠囊的粒徑分布圖，可見其平均粒徑是63 nm,為小單室脂質體，具有高透膜性,可跨越上皮細胞進入循環系統。由插圖可見納米膠囊分散均勻,相態穩定。

圖6 光響應茶皂苷元納米膠囊的粒徑分布圖

Zata電位是指剪切面的電位,是度量顆粒之間相互排斥或吸引力強度的。分子或分散粒子越小,Zeta電位的絕對值(正或負)越高,體系越穩定,即溶解或分散可以抵抗聚集。反之,Zeta電位越低,越傾向于凝結或凝聚,即吸引力超過了排斥力,分散被破壞而發生凝結或凝聚。圖7 為光響應茶皂苷元納米囊Zeta電位測定結果,其值為-43.9 mV左右。通常,±40～±60 mV具有較好的穩定性,體系的Zeta電位絕對值大于60 mV,則具有極好的穩定性。實驗結果表明,光響應茶皂苷元納米囊都具有較好的穩定性。

圖7 光響應茶皂苷元納米囊Zeta電位

4.3 抗菌實驗

光響應茶皂苷元納米膠囊無光照組抗菌實驗如圖8所示,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制和殺滅效果(見表1)。藥液的質量濃度與抗菌效果成正相關。光響應茶皂苷元納米膠囊在質量濃度為16 g/L和32 g/L時分別對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有殺滅作用；在其他濃度下可抑制菌種的生長。初步實驗結果表明光響應茶皂苷元納米囊的滅菌效果優于茶皂素的滅菌效果[15]。

5 結語

作為具有高度開放性的研究性綜合實驗,本實驗不局限于所給出的方案,可以在多個方面進行拓展。例如：化學類專業學生可以側重于制備和分析,起始原料可以從茶葉開始,也可以選用其他的皂苷類物質制備皂苷元，采取不同的提取方法，從多個角度鑒定其結構和性質；制藥工程專業可以從原料藥的角度監控質量,在檢測方面可以測定脂質體的包封率和累計釋放率等，也可以再選做不同的制劑進行對比；生物類專業的學生可以從抗菌等角度研究其生理和藥理作用。甚至可以擴展到材料類專業的學生,選用多種納米膠囊的材料和不同的制備方法。

經過幾年的探索和實踐證明,綜合實驗有利于激勵學生的求知愿望,有利于提高學生的實驗技能和綜合運用知識的能力。而研究型綜合實驗有利于學生獨立思考、創新、綜合運用等能力的培養和提高。本文所設計的綜合實驗結合了有機化學、分析化學、藥物化學、藥物合成、生物化學等專業的基本理論知識，形成了完整的研發流程，完成了藥物制備、性能檢測、數據整理和分析、撰寫報告等環節。 通過“實驗準備、實驗實施、實驗總結”3個環節的漸進式訓練,學生經歷了完整的科學研究過程,有利于提高學生融會貫通、舉一反三、勇于創新的能力和培養嚴謹認真的科學態度、科學精神。

表1 不同質量濃度的光響應茶皂苷元納米膠囊對不同菌種的抑制效果

注：+號越多菌越多。

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Research on preparation of photo-responsive theasapogenol nanocapsules and its antibacterial activity

Liu Huanai,Yang Qian, Ye Yong

(School of Chemistry and Chemical Engineering, South China Technology of University, Guangzhou 510640, China)

The comprehensive research experiment of “Preparation and antibacterial activity of photo-responsive theasapogenol nanocapsules” based on the scientific research is introduced. Through this experiment, the students can experience a complete research process which includes searching literatures, understanding the experimental principles, determining the research ideas and strategies, doing the preparation of products, characterizing the performance, processing the data, carrying out the analysis and discussion, writing experimental reports, etc., and master the related knowledge of hydrolysis and purification of natural products, nanocapsules preparation, chemical properties of matter, spectral characterization, antibacterial activity, etc. The practice shows that this experiment is clearly targeted and helpful to improve the students’ enthusiasm, initiative and comprehensive experimental skills. It is beneficial for the students to cultivate their innovative awareness and scientific spirit.

nanocapsules; research comprehensive experiment; theasapogenol; antibacterial activity

2017-03-19

國基自然科學基金項目(81173646)；華南理工大學教研教改重點項目(Y9160490)

劉華鼐(1974—),女,山西太原,碩士,實驗員,主要從事制藥工程專業實驗教學和藥物合成的設計研究.E-mail：liuhn@scut.edu.cn

TQ423；G642.423

B

1002-4956(2017)08-0038-05