p75NTR對乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR耐藥及細胞周期的影響

鄧曉芳，徐崗，何利珍

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院內二科1、胸外科2、病理科3，廣東廣州510095)

p75NTR對乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR耐藥及細胞周期的影響

鄧曉芳1，徐崗2，何利珍3

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院內二科1、胸外科2、病理科3，廣東廣州510095)

目的探討神經營養因子受體(p75NTR)對乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR化療耐藥性及細胞周期的影響。方法采用CCK-8法檢測轉染p75NTR及p75NTR-siRNA后乳腺癌耐藥細胞系MDA-MB-231/ ADR對耐藥的影響；FCM檢測轉染p75NTR及p75NTR-siRNA的乳腺癌及耐藥細胞的細胞周期分布及細胞凋亡的影響。結果過表達p75NTR可有效增強MDA-MB-231/ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性(P＜0.05)；抑制p75NTR的表達可抑制MDA-MB-231/ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性(P＜0.05)。轉染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，G0/G1期細胞增至(61.12± 1.89)%，S期細胞減至(32.76±0.23)%，凋亡率減至(16.83±1.29)%，差異有統計學意義(P＜0.05)；轉染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1細胞的細胞周期于G0/G1期減至(39.26±1.31)%，S期細胞增至(52.88±1.74)%，凋亡率增至(21.49±1.41)%,差異有統計學意義(P＜0.05)。結論過表達p75NTR能夠使乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR細胞周期阻滯于G0/G1期，促進細胞存活，抑制其凋亡，降低MDA-MB-231/ADR細胞對化療藥物的敏感性而促進其多藥耐藥性。

乳腺癌；神經營養因子受體；多藥耐藥；細胞周期

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在國內發病率每年增加約3%[1]。提高乳腺癌的治療療效是目前亟待解決的問題之一。特別是三陰型乳腺癌，惡性程度高、進展快、侵襲性強，更易復發和轉移。三陰型乳腺癌的分子靶向治療作為一種新的治療方式正逐漸得到研究和應用[2]。神經營養因子受體(the neurotrophins receptor p75，p75NTR)是神經營養因子受體，本小組在前期研究中發現p75NTR的表達可能與三陰乳腺癌及Luminal B亞型相關[3]，并利用基因重組技術，構建了p75NTR的正義及反義表達載體，成功轉染至乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR中[4]。但p75NTR與乳腺癌耐藥之間的關系尚未完全明確，本研究擬進一步以p75NTR為靶點，對轉染后細胞進行耐藥性、細胞周期及凋亡等方面的研究，探討其可能影響乳腺癌耐藥細胞耐藥的部分機制。

1 材料與方法

1.1 材料乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于軍事科學研究院，乳腺癌耐藥細胞系MDA-MB-231/ ADR由本所建立；RPMI1640培養基、胎牛血清購自Gibco；阿霉素(ADM)購自深圳萬樂藥業公司；吉西他濱(GEM)購自江蘇豪森藥業公司；奧沙利鉑(OXA)購自山東齊魯藥業公司；ECL Western blot檢測試劑盒購自Amersham公司。

1.2 細胞培養MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI1640培養液，MDA-MB-231/ADR在上述培養條件下，加入1.0 μg/mLADM培養，細胞置于含5% CO2飽和濕度，37℃培養箱中培育。實驗前2周更換為不含ADM的RPMI1640培養液，經3～4次傳代后，取對數生長細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測p75NTR對MDA-MB-231/ ADR細胞耐藥性的影響取對數生長期的各轉染細胞，制備成單細胞懸液，記數細胞，調整細胞密度為6× 104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中。實驗分成四組：MDA-MB-231/ADR-p75NTR組、MDA-MB-231/ ADR-pcDNA3.1組、MDA-MB-231/ADR-p75NTR-siRNA組、MDA-MB-231ADR-siRNA組；每組設3個復孔，細胞培養24 h后，分別加入不同濃度GEM(0.02 μg/mL、0.2 μg/mL、2 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL)、OXA(0.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、240 μg/mL)和ADM(0.2 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100、150 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)；在培養箱中培養48 h，檢測各組細胞的OD值，計算細胞增殖抑制率(IR)，IR=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%，得到半數抑制濃度(IC50)值。

1.4 FCM法檢測p75NTR對MDA-MB-231/ ADR細胞周期的影響取對數生長期的各轉染細胞，制備成單細胞懸液，調整細胞密度為6×104個/mL，接種于6孔板中，2 mL/孔。實驗分組同1.3部分。每組設3個復孔，細胞培養24 h后，分別加入同一濃度(按1.3的方法獲得的IC50值的濃度)的ADM；繼續培養48 h，收集細胞用PBS洗滌3次，上流式細胞儀檢測。

1.5 FCM檢測p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞凋亡改變的影響取對數生長期的各轉染細胞，實驗分組同1.3部分。培養、收集、洗滌并重懸細胞，加入5 μL Annexin VFITC，輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育10 min，再加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min，輕輕振蕩混勻，上流式細胞儀檢測。

1.6 統計學方法應用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測p75NTR對MDA-MB-231/ ADR細胞耐藥性的參與作用CKK-8檢測結果(表1)顯示，MDA-MB-231/ADR對ADM、GEM和OXA均顯示其耐藥性。轉染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR、MDA-MB-231-p75NTR細胞對三種抗腫瘤藥物的耐藥性增強，差異有統計學意義(P＜0.05)；轉染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1、MDA-MB-231-p75NTRsi1細胞對三種抗腫瘤藥物的敏感性增強，差異有統計學意義(P＜0.05)；結果提示過表達p75NTR可有效增強MDA-MB-231/ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性；抑制p75NTR的表達可抑制MDA-MB-231/ ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性。

表1 p75NTR對乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR耐藥的參與作用

表1 p75NTR對乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/ADR耐藥的參與作用

組別孔數IC50(μg/mL) MDA-MB-231/ADR-p75NTR MDA-MB-231/ADR-pcDNA t值P值MDA-MB-231/ADR-pSilencer MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1 t值P值3 3 3 3 ADM 183.37±4.45 124.28±4.94 8.31＜0.05 124.48±4.35 66.9±3.17 13.15＜0.05 GEM 25.43±2.15 12.13±2.02 9.76＜0.05 13.24±1.86 7.36±1.43 15.48＜0.05 OXA 65.72±1.85 38.45±1.56 11.78＜0.05 40.15±1.73 28.17±1.42 12.86＜0.05

2.2 p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞周期影響FCM檢測結果(圖1和表2)顯示，轉染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，于G0/G1期增多，S期細胞減少；轉染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1細胞組的細胞周期于G0/G1期減少，S期細胞增多，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 FCM檢測p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞的細胞周期分布影響

圖2 FCM檢測p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞的凋亡的影響

表2 p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞的周期分布及凋亡的影響

表2 p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞的周期分布及凋亡的影響

組別孔數細胞周期凋亡S MDA-MB-231/ADR-p75NTR MDA-MB-231/ADR-pcDNA t值P值MDA-MB-231/ADR-pSilencer MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1 t值P值3 3 3 3 G0/G161.12±1.89 51.57±1.28 3.68＜0.05 52.43±1.74 39.26±1.31 11.49＜0.05 32.76±0.23 42.68±1.37 4.51＜0.05 43.19±1.16 52.88±1.74 12.12＜0.05 G2/M 6.12±0.48 5.75±0.88 3.8＜0.05 4.38±0.73 7.86±1.02 16.09＜0.05 16.83±1.29 18.59±1.53 6.59＜0.05 20.57±1.65 21.49±1.41 7.24＜0.05

2.3 p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞凋亡的影響p75NTR可影響MDA-MB-231/ADR細胞凋亡。FCM檢測結果(圖2和表2)顯示，轉染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR細胞的凋亡率減少，存活率增多；轉染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1細胞組的凋亡率增多，存活率減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

p75NTR又名神經生長因子受體(nerve growth factor receptor，NGFR)，定位于人染色體17q12-17q22，包含6個外顯子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族的一員。現有研究表明p75NTR的表達有利于促進食管癌、乳腺癌細胞的生長和強烈抵制抗腫瘤治療[5-6]，也可以作為生存受體促進黑色素瘤細胞的腦轉移[7]。p75NTR陽性腫瘤表現了許多三陰型乳腺癌的特征，如高組織分化，高增殖指數及與肌上皮細胞標志物相關[8]。三陰型乳腺癌惡性程度高，易轉移復發，臨床治療效果差，預后差[9]，推測可能與此機制有關。隨著對p75NTR研究的深入，發現多種藥物可通過作用于p75NTR起到調控腫瘤細胞耐藥的作用[10-12]。通過用p75NTR的過表達載體上調乳腺癌細胞中p75NTR的表達；p75NTR特異性siRNA抑制乳腺癌細胞中p75NTR的表達，發現過表達p75NTR可有效增強MDA-MB-231/ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性；抑制p75NTR的表達可降低MDA-MB-231/ ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性。

惡性腫瘤的發生發展通常表現為細胞周期異常、細胞周期調控機制紊亂以及腫瘤細胞的無限增殖。G1/S期和G2/M期是細胞周期的關鍵點。Vrbeke等[13]的研究認為p75NTR的過表達，可上調p21，而p21是細胞周期cyclin/CDK抑制劑，抑制細胞從G1期到S期，使細胞停留在G0/G1期，處于慢周期或靜息狀態，對化療藥物敏感性下降，增加了細胞的耐藥性。本研究發現p75NTR對MDA-MB-231/ADR細胞周期有一定影響，過表達p75NTR細胞可使細胞周期阻滯于G0/G1期，G0/G1期細胞比率高于MDA-MB-231/ ADR-pcDNA組，S期細胞比率亦低于后者；抑制p75NTR表達后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1細胞組的細胞周期于G0/G1期細胞比率低于MDA-MB-231/ADR-pSilencer組，S期細胞比率高于后者。本結果提示，通過調節p75NTR的表達可影響耐藥細胞周期進程從而在發病過程中發揮重要作用，過表達p75NTR使MDA-MB-231/ADR細胞周期阻滯于G0/G1期，增殖細胞不能通過“G1/S”調節點，處于慢周期或靜息狀態的細胞增多，細胞增殖延緩，對化療敏感性下降，增加了細胞的耐藥性。而抑制p75NTR的表達使MDA-MB-231/ADR細胞周期于G0/G1期減少，處于慢周期或靜息狀態細胞減少，細胞增殖加快，對化療敏感性增加，從而逆轉細胞的耐藥性。

p75NTR可通過減少腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的PARP和caspase3分解促進細胞的存活，且其促生存作用是獨立的，與PI3-激酶，MAPK和NF-κB無關，提示p75NTR可通過多元通路發揮其促生存作用[14]。本研究FCM檢測結果顯示，過表達p75NTR的MDA-MB-231/ADR-p75NTR細胞凋亡率明顯低于抑制p75NTR表達的MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1細胞，證實過表達p75NTR細胞更能抵抗凋亡，而抑制p75NTR的表達使MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1細胞的凋亡率增加。誘導細胞凋亡是絕大多數抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細胞的共同通路，凋亡受抑可能是腫瘤細胞產生耐藥的機制之一，Asakura等[15]認為在凋亡過程中Bcl-2/Bax的比值參與調節線粒體滲透小孔使細胞色素C從線粒體釋放到胞液，這與其他關于多藥耐藥性發生機制一樣具有普遍意義。

綜上所述，過表達p75NTR可有效增強MDA-MB-231/ADR細胞對ADM、GEM和OXA的耐藥性，使MDA-MB-231/ADR細胞周期阻滯于G0/G1期，并更能抵抗細胞的凋亡，抑制p75NTR表達則呈相反的效應。這為p75NTR增強乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/ADR耐藥的研究提供實驗依據，但其在細胞內通過何種分子信號轉導通路參與了乳腺癌耐藥細胞的耐藥機制還需要進一步的研究。

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Effects of neurotrophin receptor p75NTR on drug resistance and cell cycle in breast cancer resistant cell line MDA-MB-231/ADR.

DENG Xiao-fang1,XU Gang2,HE Li-zhen3.Second Department of Internal Medicine1,Department of Thoracic Surgery2,Department of Pathology3,Cancer Center of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of neurotrophin receptor p75NTR on drug resistance and cell cycle in breast cancer resistant cell line MDA-MB-231/ADR.Methods The multi-drug resistance effects of the overexpression and knock-down p75NTR on breast cancer cell line MDA-MB-231/ADR were detected by CCK-8 assay.Flow cytometry(FCM)was used to detect the effects of the overexpression and knock-down of p75NTR on the cell cycles distribution and apoptosis.ResultsThe overexpression of p75NTR can effectively enhance the resistance of MDA-MB-231/ADR cells to Doxorubicin(ADM),Gentamicin(GEM)and Oxacillin(OXA)(P＜0.05).The inhibition of p75NTR expression can increase the sensitivity of MDA-MB-231/ADR cells to ADM,GEM and OXA(P＜0.05).After the transfection of pcDNA3.1-p75NTR,MDA-MB-231/ADR-p75NTR cell cycle arrested in G0/G1phase.The number of cells in G0/G1phase increased to(61.12±1.89)%and those in S phase decreased to(32.76±0.23)%.Additionally,apoptosis rate in S phase decreased to(16.83±1.29)%,P＜0.05.After the transfection of p75NTR-siRNA,the number of cells in G0/G1phase decreased to(39.26±1.31)%and those in S phase increased to(52.88±1.74)%.And apoptosis rate in S phase increased to(21.49±1.41)%(P＜0.05).ConclusionThe overexpression of p75NTR can make MDA-MB-231/ADR cell cycle arrest in G0/G1phase,promote cell survival,inhibit the apoptosis,reduce the sensitivity to chemotherapeutic drugs and promote its multidrug resistance.

Breast cancer;Neurotrophin receptor p75/p75NTR;Multidrug resistance;Cell cycle

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.002

R737.9

A

1003—6350（2017）15—2414—04

2017-05-17)

廣東省衛生計生委醫學科研基金(編號：B2016070)；廣州醫科大學科研資助項目(編號：2015C42)

鄧曉芳。E-mail：dengxf2046@126.com