Ath-miR169d介導的擬南芥葉片發育的分子調控機制

張敏，朱明,，李文宗，馬潔，劉悅萍，江海洋，王磊，徐妙云

?

Ath-miR169d介導的擬南芥葉片發育的分子調控機制

張敏1，朱明1,2，李文宗1，馬潔3，劉悅萍3，江海洋2，王磊1，徐妙云1

（1中國農業科學院生物技術研究所，北京100081；2安徽農業大學生命科學學院，合肥230036；3北京農學院生物科學與工程學院，北京102206）

【目的】探究ath-miR169d在擬南芥葉片發育過程中的作用，明確其調控的分子機制，為增強葉菜類植物的光合效率以及增加生物量和提高作物產量提供理論依據。【方法】選取ath-miR169d過表達和降低表達的擬南芥轉基因株系以及野生型擬南芥，在22℃、相對濕度60%、16 h/8 h光周期條件下培養，觀察不同生長階段葉片發育表型的差異；同時構建pmiR169d::GUS表達載體，轉化農桿菌EHA105，并利用蘸花法轉化野生型擬南芥（Columbia，Col-0），獲得轉基因擬南芥，利用GUS染色對ath-miR169d在擬南芥不同組織器官中的表達模式進行研究；選取8周齡的過表達材料和野生型對照株系，對其葉片表皮細胞形態進行掃描電鏡分析；對4周齡過表達材料和野生型對照株系的幼苗頂端分生組織和葉片中總IAA進行定量分析，并進行基因芯片表達譜分析，篩選差異表達基因；通過實時熒光定量PCR對生長素信號途徑部分差異表達關鍵基因的表達情況進行分析。【結果】Ath-miR169d過表達擬南芥株系蓮座葉數目較野生型少，葉片小，而ath-miR169d降低表達的擬南芥株系的蓮座葉較野生型多，葉片大，且在抽薹和種子成熟之后還持續長出新葉，而野生型蓮座葉則在種子成熟之后逐漸衰老干枯；掃描電鏡觀察到ath-miR169d過表達擬南芥株系葉片中表皮細胞小于野生型；表達模式分析表明，ath-miR169d主要在頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）和葉片維管系統中表達，且新葉中表達強。SAM是產生生長素的部位，IAA測定結果表明ath-miR169d過表達擬南芥株系中IAA含量顯著降低，為野生型植株的38.6%，同時基因芯片表達譜分析也驗證了ath-miR169d參與調控植物體內激素信號轉導途徑。進一步研究發現，ath-miR169d過表達株系中生長素合成關鍵基因和轉運體蛋白基因均顯著下調表達，而具有轉錄抑制功能的生長素響應因子1和2基因（和）表達上調；STTM miR169d低表達株系中這4個基因的表達則為相反趨勢，該結果與觀察到的表型相一致。【結論】Ath-miR169d通過介導生長素信號途徑參與了擬南芥葉片發育的調控，ath-miR169d表達量發生變化會影響葉片的數量和大小，最終影響整個植株的生物量。

擬南芥；miR169；葉片；發育；生長素信號途徑

0 引言

【研究意義】在農業生產中，尤其對于食葉類蔬菜等，提高植物生物量，可以提高生產效率，降低成本，具有重要意義。葉片作為光合作用的器官，對于植物的發育和生物量的積累至關重要。葉片的發育包括葉原基的起始、極性的建立和葉片的擴展。葉片的發育受小RNA、轉錄因子和激素的協調調控[1]。越來越多的研究表明，miRNA作為一個關鍵調控因子啟動和參與植物體內多條發育途徑。植物中最大的miR169家族基因，參與植物的逆境響應和生長發育調控。利用已有的過表達和低表達的轉基因擬南芥材料，解析其介導葉片發育調控的分子機制，可為調節植物營養生長，增加總生物量提供理論依據。【前人研究進展】MiR156/SPL調控模塊與TCP4互作形成的復合體參與擬南芥的葉片發育[2]。miR160通過靶向調節3個ARF同源基因、和參與調控葉原基的形成和蓮座葉正確葉序的建立[3-5]。MiR164通過對（CUP-SHAPED COTYLEDON1）和的調控介導器官邊界的形成[5-7]。miR319通過對的靶向調節參與葉片發育過程中的細胞分裂和生長[8-9]。生長素產生于頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM），參與調節植物發育的多個過程，包括根和葉片形態建成、器官形成和維管組織的發育等[10]。生長素的合成涉及多條發育進程[11]，其中主要的天然生長素形式，吲哚乙酸IAA的合成主要經過兩步化學反應，首先色氨酸（Trp）通過轉氨作用形成吲哚丙酮酸（IPA），然后IPA再被YUCCA（YUC）家族基因編碼的含黃素單加氧酶催化形成IAA[12]。目前研究發現，PIN蛋白家族是主要的介導生長素由胞內向胞外、以及細胞之間定向移動的轉運體[13]。擬南芥miR169家族包括14個基因，最終產生4個成熟的miRNA異構體（a、b/c、d/e/f/g和h/i/j/k/l/m/n）。不同的miR169異構體在植物發育過程中表達模式不同[14]，其靶基因是轉錄因子NF-Y的A亞基[15]。NF-YA與NF-YB、NF-YC形成三聚體，發揮調控功能。研究表明，NF-Y轉錄因子參與植物發育、信號轉導和逆境響應[16-22]。并且擬南芥miR169d/NF-YA2調控模塊介導逆境誘導的早花[23]和根形態建成[24]。【本研究切入點】在前期研究中，發現過表達轉基因植株蓮座葉的生長受到影響，但其是否參與葉片發育的調控及其分子機制還未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過對不同轉基因材料的蓮座葉表型、葉片表皮細胞的形態等指標的觀察，結合表達模式的分析，以及內源生長素的定量檢測和基因表達情況檢測等研究，明確對葉片發育的影響，進而解析其分子調控機制。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在中國農業科學院生物技術研究所完成。

1.1 植物材料

擬南芥哥倫比亞生態型（Col）。植物生長條件為22℃，相對濕度60%，光周期16 h/8 h。株系為作物基因組與遺傳改良實驗室保存[23]。

1.2 pmiR169d::GUS載體的構建和轉基因株系的獲得

通過PCR方法從基因組DNA中擴增ath-miR169d前體序列上游2 kb片段（引物序列分別為pmiR169d- FW：5′-ACCCTAACTCATGATGAAGG-3′和pmiR169d- RV：5′-CACCTGTCGACGTACTAGATC T-3′）。與pEASY-T1載體連接，轉化，經測序驗證后重組至植物雙元載體pCAMBIA1303。并經蘸花法轉化擬南芥Col野生型，篩選獲得至少10個獨立轉化事件的轉基因陽性材料。

1.3 STTM載體構建和轉基因株系的獲得

STTM是一類短的（~100 nt）人工合成非編碼RNA，參照文獻[25]模擬miR169d的前體序列，設計STTM序列（5′-caagtcatcTACcttg gctcaGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATA-3′，5′-TGGTCTAAAGAAGAAGAATcaagtcatcTACcttggctca-3′），斜體部分分別為HⅠ和Ⅰ酶切位點，中間48 nt為linker序列，可以形成一個弱的頸環結構，小寫字體為能夠與互補配對的序列，其中10—12 nt設計為3個不配對堿基突出部分，從而可以與結合并不被其降解，導致沉默。經測序驗證正確后酶切連接至植物雙元載體載體pPZP212上。該載體經蘸花法轉化擬南芥Col野生型，并篩選獲得至少10個獨立轉化事件的轉基因陽性材料。

1.4 GUS染色

為了全面分析在擬南芥中的表達情況，將不同齡期的幼苗整株進行染色。具體步驟參考文獻[26]方法。

1.5 總RNA、miRNA提取和實時熒光定量PCR

利用Trizol（ambion）提取擬南芥總RNA，然后將總RNA反轉錄成cDNA（5×All-In-One RT MasterMix，abm，加拿大）。使用SYBR Premix Ex TaqTM（CodeQPK-201，TOYOBO）試劑進行實時熒光定量PCR分析，擬南芥作為內參。利用miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501，TIANGEN，北京）提取擬南芥的miRNA，然后反轉錄為cDNA（TIANGEN miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR201），再用TIANGEN miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP401），進行熒光定量PCR。擬南芥作為內參。每個基因型均做3個獨立生物學重復，包含至少3個以上單株樣品。所用儀器為ABI7500，利用2–ΔΔCT方法分析試驗結果[27]，所用引物序列見表1，miRNA熒光定量的反向引物為試劑盒自帶通用引物。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.6 IAA的定量分析

16 h/8 h光周期條件下培養4周的擬南芥幼苗地上部分全部收獲，轉基因材料和野生型分別隨機選5株混樣（200 mg），委托中國科學院遺傳發育研究所利用氣相色譜-質譜聯用進行IAA定量分析。

1.7 基因芯片分析

分別提取轉基因株系和野生型的總RNA，利用Agilent 2100分析儀器檢測總RNA的質量和數量，并通過變性瓊脂糖凝膠檢測RNA的完整度，對質檢合格的RNA樣品委托上海歐易公司進行基因芯片分析，所用芯片為擬南芥Agilent V4.0。

2 結果

2.1影響擬南芥蓮座葉生長

前期研究發現ath-不僅參與調控擬南芥的開花時間[23]，同時也影響葉片的發育，過表達擬南芥的蓮座葉與野生型相比少且小。為探究其對葉片發育的調控功能，通過構建并獲得STTM[25]的轉基因擬南芥株系，抑制了內源的表達。如圖1-a為STTM的轉基因擬南芥株系中的的相對表達量。與野生型相比，STTM株系蓮座葉多且大（圖1-b、1-c）。過表達株系的蓮座葉直徑是4.29 cm，短于野生型（5.03 cm），STTM株系是6.5 cm，大于野生型（圖1-d）。而且，STTM株系會不斷生長新葉，一直持續到抽薹結實后仍有新葉的發生及生長，但野生型在抽薹結實之后就不再長新葉（圖1-c）。40 d苗齡的過表達株系蓮座葉數為13.8，野生型和STTM分別為16.6和20.4（圖1-d）。

表皮細胞的數目和大小決定了葉片的大小，為探究過表達株系葉片變小的原因，利用掃描電鏡觀察了各個擬南芥株系的表皮細胞形態。過表達株系葉片表皮細胞（圖2-a）小于野生型株系的表皮細胞（圖2-b），說明通過介導葉片表皮細胞的大小進而影響了葉片的大小。

2.3主要在擬南芥頂端分生組織和葉片維管系統中表達

為解析在擬南芥葉片發生和葉片發育中的功能，克隆的2 kb啟動子片段，構建pmiR169d::GUS表達載體并獲得了其轉基因擬南芥株系。對pmiR169d::GUS轉基因擬南芥株系染色分析結果表明，主要在頂端分生組織和葉維管系統中表達。隨著pmiR169d::GUS幼苗的生長，報告基因的表達逐漸增強，且在新生葉片中的表達高于老葉片（圖3）。頂端分生組織是葉原基形成的部位，維管系統則負責水分、礦質元素和營養物質的運輸，因而在該部位的表達可能與葉片發育相關。

2.4過表達降低了轉基因株系中內源IAA的含量

植物體內生長素主要產生于SAM，是植物器官發生的主要調節因子。考慮到在SAM中大量表達，為分析其是否影響擬南芥生長素的代謝，檢測了4周齡地上部幼苗中內源生長素的含量，發現在過表達株系中，內源IAA含量與WT相比降低了38.6%（圖4-a），說明參與了IAA代謝途徑的調控。為進一步探究參與調控葉片起始和發育的分子機制，對4周齡過表達株系幼苗進行基因芯片表達譜分析。與野生型相比，分別有2 268和2 562個基因顯著下調和上調表達（log2FC＞1 or＜-1 with-value of 0.05）。對表達發生顯著變化的基因進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析，結果表明，在富集比例前10的代謝路徑中，富集基因數量最多的是“次級代謝產物合成途徑”和“植物激素信號轉導途徑”（圖4-b），其中，有多個生長素信號途徑基因表達發生了變化。

2.5過表達株系和STTM低表達株系中生長素信號途徑基因表達發生變化

鑒于過表達擬南芥株系中IAA含量明顯下降，推測IAA合成途徑中的基因可能受到影響，通過對基因芯片表達譜分析發生IAA合成途徑關鍵基因、外運載體蛋白基因的表達明顯降低，采用qPCR的方法對這些基因在過表達株系和STTM低表達株系中的表達量進行檢測。結果表明，與野生型相比，過表達株系中和表達顯著下調，而STTM株系中這兩個基因都顯著上調表達（圖5）。過表達株系中表達下調與IAA含量降低結果吻合，IAA的減少也導致IAA轉運體的下調表達。Ellis等[28]報道IAA應答因子和的過表達促進葉片衰老，為了進一步分析和在過表達植株和低表達株系中的作用，對其表達進行了分析，結果表明，在過表達植株中和的表達明顯上升，在低表達株系中則顯著下調表達，因是轉錄抑制因子，推測其上調表達阻礙了葉片的發育，并促進植株衰老。

對于無數據區域，須將 NoData轉為數值0，否則獲得的陰影數據不完整，選擇 [Spatial Analyst 工具][分類][重分類]工具完成，如圖4。

3 討論

miR169家族是植物中最大且進化保守的一個miRNA家族，其家族成員在調節脅迫應答和生長發育過程中發揮著重要的作用，的靶基因主要是NF-YA轉錄因子，miR169/NF-YA這個調控模塊可以感受內源信號或外部環境的激活，使植物表現出增強適應內外環境變化的特性。對蒺藜狀苜蓿的研究發現，在的5′端有一個內含子可以進行選擇性剪切，在這個區域中有一個ORF可以編碼一個蛋白（uORF1p），這個蛋白的表達可以下調，其與呈現出功能上的互補，在根瘤發育的早期階段調控占主導地位，而在后期時uORF1p發揮顯著功能[29]。LI等[21]研究表明miR169/NF-YA5調控模塊可以響應干旱并提高擬南芥的抗旱性，擬南芥在缺水環境中表達受到抑制，也就脫離了的控制而上調表達，進而使植物抗旱性增強，經過進一步研究發現這條通路是ABA介導的。這些研究使得NF-YA的上游調控機制變得更加清晰，也為植物環境脅迫下的分子應答機制研究提供了理論支撐。作物基因組與遺傳改良研究室王磊課題組前期在擬南芥中發現了受逆境脅迫誘導的另一個模塊miR169/NFYA2，它可以通過響應逆境使植物提前開花，并且miR169/NF-YA2調控模塊所引起的早花現象獨立于其他開花調控途徑[23]。而且異構體及其靶基因參與調控了擬南芥根的形態建成[24]。根中轉錄因子和會響應磷饑餓而顯著上調表達[30]。這些研究結果表明，及其靶基因家族成員，可以直接或間接地作為發育與響應非生物逆境之間的一個感應子或者連接體，發揮重要的功能。

生長素是植物體內重要的生長發育調控因子，各種來自外界的逆境均可以影響其在植物體內的穩態和轉運，從而影響植物的生長發育[31]。本研究發現擬南芥的表達發生變化會影響蓮座葉的生長，并且這種作用是通過生長素信號途徑介導的，從而發現了一個新的調控功能。這種調控功能在蔬菜類作物中展現了應用前景。但是，miRNA都是通過對靶基因的調控實現其功能，本研究中如何通過其靶基因NF-YA家族調控了生長素途徑還需要進一步研究分析。另外，在前期研究中發現也參與擬南芥開花時間的調控，那么生長素是否也介導了這一生物學過程？是如何協調介導葉片發育和開花時間的調控等問題，都值得進一步探討。

4 結論

通過介導生長素信號途徑參與了擬南芥葉片發育的調控，表達量發生變化會影響葉片的數量和大小，最終影響整個植株的生物量。

References

[1] MOON J, HAKE S. How a leaf gets its shape., 2011, 14(1): 24-30.

[2] RUBIO-SOMOZA I, ZHOU C M, CONFRARIA A, MARTINHO C, VON BORN P, BAENA-Gonzalez E, Wang J W, Weigel D. Temporal control of leaf complexity by miRNA-regulated licensing of protein complexes., 2014, 24(22): 2714-2719.

[3] Mallory A C, Bartel D P, Bartel B. MicroRNA-directed regulation ofAUXIN RESPONSE FACTOR17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes., 2005, 17(5): 1360-1375.

[4] Wang J W,Wang L J, Mao Y B, Cai W J, Xue H W, Chen X Y. Control of root cap formation by MicroRNA-targeted auxin response factors in., 2005, 17(8): 2204-2216.

[5] Liu P P,Montgomery T A, Fahlgren N, Kasschau K D, Nonogaki H, Carrington J C. Repression of AUXIN RESPONSE FACTOR10 by microRNA160 is critical for seed germination and post-germination stages., 2007, 52(1): 133-146.

[6] Mallory A C, Dugas D V, Bartel D P, Bartel B. MicroRNA regulation of NAC-domain targets is required for proper formation and separation of adjacent embryonic, vegetative, and floral organs.,2004, 14(2):1035-1046.

[7] Sieber P, Wellmer F, Gheyselinck J, Riechmann J L, Meyerowitz E M. Redundancy and specialization among plant microRNAs: role of the MIR164 family in developmental robustness.,2007, 134(6): 1051-1060.

[8] Palatnik J F,Allen E Wu X, Schommer C, Schwab R, Carrington J C, Weigel D.Control of leaf morphogenesis by microRNAs., 2003, 425(6955): 257-263.

[9] Ori N,Cohen A R, Etzioni A, Brand A, Yanai O, Shleizer S, Menda N, Amsellem Z, Efroni I, Pekker I, Alvarez J P, Blum E, Zamir D, Eshed Y. Regulation of LANCEOLATE by miR319 is required for compound-leaf development in tomato., 2007, 39(6): 787-791.

[10] Millner P A,Cohen A R, Etzioni A, Brand A, Yanai O, Shleizer S, Menda N, Amsellem Z, Efroni I, Pekker I, Alvarez J P, Blum E, Zamir D, Eshed Y. The auxin signal., 1995, 39(6): 224-231.

[11] Chandler J W. Local auxin production: a small contribution to a big field., 2009, 31(1): 60-70.

[12] Won C, Shen X, Mashiguchi K, Zheng Z, Dai X, Cheng Y, Kasahara H, Kamiya Y, Chory J, Zhao Y. Conversion of tryptophan to indole-3-acetic acid by TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASES OF ARABIDOPSIS and YUCCAs in., 2011, 108(45): 18518-18523.

[13] Friml J, Benkova E, Mayer U, Palme K, Muster G. Automated whole mount localisation techniques for plant seedlings., 2003, 34(1): 115-124.

[14] Gonzalez-Ibeas D, Blanca J, Donaire L, Saladié M, Mascarell Creus A, Cano Delgado A, Garcia Mas J, Llave C, Aranda M A. Analysis of the melon () small RNAome by high-throughput pyrosequencing., 2011, 12: 393.

[15] Rhoades M W, Reinhart B J, Lim LP, Burge C B, Bartel B, Bartel D P. Prediction of plant microRNA targets., 2002, 110(4): 513-520.

[16] Lotan T, Ohto M, Yee K M, West M A, Lo R, Kwong R W, Yamagishi K, Fischer R L, Goldberg R B, Harada J J.LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells., 1998, 93(7): 1195-1205.

[17] Combier J P, Frugier F d e, Billy F, Boualem A, El-Yahyaoui F, Moreau S, Vernié T, Ott T, Gamas P, Crespi M, Niebel A. MtHAP2-1 is a key transcriptional regulator of symbiotic nodule development regulated by microRNA169 in., 2006, 20(22): 3084-3088.

[18] Wenkel S,Turck F, Singer K, Gissot L, Le Gourrierec J, Samach A, Coupland G. CONSTANS and the CCAAT box binding complex share a functionally important domain and interact to regulate flowering of., 2006, 18(11): 2971-2984.

[19] Warpeha K M, Upadhyay S, Yeh J, Adamiak J, Hawkins S I, Lapik Y R, Anderson M B, Kaufman L S. The GCR1, GPA1, PRN1, NF-Y signal chain mediates both blue light and abscisic acid responses in., 2007, 143(4): 1590-1600.

[20] Nelson D E,Repetti P P, Adams T R, Creelman R A, Wu J, Warner D C, Anstrom D C, Bensen R J, Castiglioni P P, Donnarummo M G, Hinchey B S, Kumimoto R W, Maszle D R, Canales R D, Krolikowski K A, Dotson S B, Gutterson N, Ratcliffe O J, Heard J E. Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres., 2007, 104(42): 16450-16455.

[21] Li W X, Oono Y, Zhu J, He X J, Wu J M, Iida K, Lu X Y, Cui X, Jin H, Zhu J K. TheNFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance., 2008, 20: 2238-2251.

[22] Liu J X, Howell S H. bZIP28 and NF-Y transcription factors are activated by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response genes in., 2010, 22: 782-796.

[23] Xu M Y, Zhang L, Li W W, Hu X L, Wang M B, Fan Y L, Zhang C Y, Wang L. Stress-induced early flowering is mediated by miR169 in., 2014, 65: 89-101.

[24] Sorin C, Declerck M, Christ A, Blein T, Ma L, Lelandais-Brière C, Njo M F, Beeckman T, Crespi M, Hartmann C. A miR169 isoform regulates specific NF-YA targets and root architecture in., 2014, 202: 1197-1211.

[25] Yan J, Gu Y, Jia X, Kang W, Pan S, Tang X, Chen X, Tang G. Effective small RNA destruction by the expression of a short tandem target mimic in., 2012, 24(2): 415-427.

[26] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants., 1987, 6(13): 3901-3907.

[27] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method., 2001, 25(4): 402-408.

[28] Ellis C M, Nagpal P, Young J C, Hagen G, Guilfoyle T J, Reed J W. AUXIN RESPONSE FACTOR1 and AUXIN RESPONSE FACTOR2 regulate senescence and floral organ abscission in., 2005, 132(20): 4563-4574.

[29] Combier J P, de Billy F, Gamas P, Niebel A Rivas S. Trans-regulation of the expression of the transcription factor MtHAP2-1 by a uORF controls root nodule development., 2008, 22: 1549-1559.

[30] Woo J, MacPherson C R, Liu J, Wang H, Kiba T, Hannah M A, Wang X J, Bajic V B, Chua N H. The response and recovery of thetranscriptome to phosphate starvation., 2012, 12: 62.

[31] Lavy M, Estelle M. Mechanisms of auxin signaling., 2016, 143(18): 3226-3229.

（責任編輯 李莉，岳梅）

Molecular regulation mechanism of leaf development mediated by ath-miR169d in

ZHANG Min1, ZHU Ming1,2, LI WenZong1, MA Jie3, LIU YuePing3, JIANG HaiYang2, WANG Lei1, XU MiaoYun1

(1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;3Colloge of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

【Objective】The aims of this study are 1) to analyze the role of ath-miR169d in the progress of leaf development in, 2) to illuminate the mechanisms of molecular regulation mediated by ath-miR169d, and 3) to provide a new insight into improving the photosynthetic performance and the genetic engineering of vegetables biomass and crop productivity.【Method】Ath-miR169d over-expression transgenic plants, STTM ath-miR169d knockdown transgenic plants, and WT plants were grown in a controlled culture room at 22℃ with a relative humidity of 60% and 16 h/8 h photoperiod. Number and size of rosette leaf were measured; pmiR169d::GUS vector were constructed and transformed intoEHA105, and then infected the buds of wildtype(Columbia, Col-0), the pmiR169d::GUS transgenicplants were used to observe the expression profile ofin different organs and tissues by GUS staining method. Using 8-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants as materials, morphology of leaf epidemic cells were observed by scanning electron microscope (SEM). Whole shoots were harvested from 4-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants, subsequently the total endogenous IAA were detected and quantified as methyl esters by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The mRNA expression profiles were detected by microarray analysis to screen differentially expressed genes. The expression of key genes in plant auxin signal pathway were verified by real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR). 【Result】In contrast to WT, ath-miR169d overexpression plants exhibited fewer and smaller rosettes, STTM ath-miR169d knockdown plants showed more and larger rosettes. Moreover, STTM ath-miR169d plants could generate new rosette leaves incessantly even after bolting and seeds harvest, whereas the leaves of ath-miR169d overexpression and WT plants generally decayed after harvest. The epidermal cells in the leaves ofath-miR169d over-expression plants were smaller than that in the WT leaves by SEM detection. Ath-miR169d was highly expressed in SAM and leaf vasculature, and expression profile was stronger in new leaves than in old ones. Endogenous IAA content reduced by 38.6% in ath-miR169d over-expressing plants compared to wild-type plants, showingwas potentially involved in auxin signal pathway by microarray analysis. The auxin biosynthesis geneand transporter genewere downregulated inover-expressing plants whereas, auxin response factors 1 and 2 (and) genes were upregulated. Expression profile of,,andSTTMplantswere opposite to over-expressing plants. 【Conclusion】Results of the experiment showed that the leaf development was regulated by ath-miR169d through the auxin-signaling pathway. Number and size of rosette could be alerted by ath-miR169d expression level, and further affected biomass of the whole plant.

; miR169; leaf; development; auxin signaling pathway

2017-02-13；接受日期：2017-04-05

國家自然科學基金（31270318）、國家“973”計劃（2014CB138205）

張敏，Tel：13126532159；E-mail：13126532159@163.com。通信作者徐妙云，E-mail：xumiaoyun@caas.cn