異色瓢蟲3個小分子熱激蛋白序列及低溫誘導表達分析

汪慧娟，趙靜，施佐堃，邱玲玉，王甦，張帆，王世貴，唐斌

?

異色瓢蟲3個小分子熱激蛋白序列及低溫誘導表達分析

汪慧娟1，趙靜2，施佐堃1，邱玲玉1，王甦3，張帆3，王世貴1，唐斌1

（1杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州310036；2濰坊科技學院植物病蟲害研究所，山東濰坊262700；3北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京100097）

【目的】異色瓢蟲()是一種重要的捕食性天敵昆蟲，廣泛應用于農林害蟲的生物防治中。本研究旨在分析探索低溫脅迫條件對3個小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHSP）抗寒基因相對表達量的影響，為異色瓢蟲低溫冷藏及其抗寒機制研究提供科學依據。【方法】在轉錄組獲得異色瓢蟲基因序列的基礎上，根據特異性引物獲得（基因登錄號：KX161871）（基因登錄號：KX161873）和（基因登錄號：KX161874）基因cDNA的開放閱讀框序列(open reading frame，ORF），采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）技術測定異色瓢蟲3個sHSP基因在不同發育階段、短時降溫和短時降溫后恢復處理、低溫儲存處理下以及不同色斑的表達水平。【結果】在不同發育階段處理中，和在蛹期及成蟲期高表達；在4齡幼蟲第4天表達量顯著高于對照組。在短時降溫處理中，在降溫至0℃和-5℃時表達量顯著高于對照組；和在降溫過程中表達量顯著降低。在短時降溫后恢復處理中，3個sHSP基因表達量無顯著差異。在低溫儲藏條件下，實驗種群：黑底雌瓢蟲表達水平在儲存第5天時顯著升高，黃底雌瓢蟲在儲存5—15 d時表達量顯著升高；黑底雌瓢蟲在儲存5—20 d時顯著性高表達，黃底雌瓢蟲在15 d時顯著性高表達；黑底和黃底雌瓢蟲無顯著性高表達；越冬種群：黑底和黃底雌瓢蟲、、在低溫儲存中均無顯著性高表達?！窘Y論】sHSP在異色瓢蟲發育階段可能發揮著作用。短時降溫脅迫能夠誘導sHSP基因高表達。實驗種群在低溫儲存條件下和均出現了顯著性高表達，表明這兩個基因在瓢蟲受到冷馴化時起到了作用。此外，不同色斑型異色瓢蟲的抗寒機制和抗寒能力有所差異。

異色瓢蟲；小分子熱激蛋白；抗寒基因；低溫儲存；實時熒光定量PCR；基因表達

0 引言

【研究意義】異色瓢蟲（）屬鞘翅目（Coleptera）瓢蟲科（Coccinellidae），對蚜蟲、葉螨、介殼蟲等重要害蟲具有很強的捕食能力，目前在農林業生產實踐中被廣泛應用[1-2]。從分子水平探討低溫誘導對異色瓢蟲抗寒基因表達水平的影響，可揭示昆蟲抗寒的機制。同時，也可為異色瓢蟲自然種群的越冬保護、人工繁殖種群的冷藏管理和在低溫環境中的釋放應用提供參考。【前人研究進展】溫度在很大程度上影響著昆蟲的生長發育、基本行為及進化途徑[3]。昆蟲在長期進化過程中形成了各種各樣的抗寒策略[4]，有的昆蟲通過遷徙或躲藏等行為避開低溫環境，有的昆蟲則會通過調節機體代謝，積累抗寒物質來抵御寒冷[5-6]。自然界中，異色瓢蟲以成蟲滯育越冬，有關異色瓢蟲抗寒性、越冬策略、季節性表型等研究已有大量報道[7-11]。熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）具有高度保守的氨基酸序列，廣泛存在于微生物及高等動植物中，當生物體遭受高溫、低溫及其他不利的環境脅迫時，HSPs對生物體的預防反應及穩定性起到重要作用[12]。根據分子量的大小，HSPs可以分為HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族以及小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHSP）家族[13]。sHSP分子量一般在15—50 kD，sHSP具有分子伴侶的功能，其能夠使蛋白質處于有利于折疊的感受態，并且與其他HSPs共同作用使蛋白質有效折疊。研究發現過量表達sHSP能增強細胞對熱休克的耐受力[14]。sHSP在對抗細胞凋亡以及生物體生長發育和分化過程中也發揮著重要作用[14]。此外，不同色斑種群的比例呈現出季節性變化，不同色斑種群異色瓢蟲成蟲的低溫存活率可能有所差異[15]?！颈狙芯壳腥朦c】有關sHSP和異色瓢蟲抗寒性關系的研究還較少，短時低溫脅迫能明顯提高異色瓢蟲抗逆能力，sHSP基因在這個過程中mRNA水平上的變化情況還有待探究?！緮M解決的關鍵問題】通過檢測3個sHSP基因在不同發育階段、短時降溫和短時降溫后恢復處理、低溫儲存處理下以及不同色斑種群的表達水平，分析其在異色瓢蟲抗寒能力中所起的作用。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在杭州師范大學完成。

1.1 試驗昆蟲

異色瓢蟲實驗種群：2014年3月底采集于杭州師范大學校園內。在溫度（25±1）℃、相對濕度為（70±5）%和光周期16L﹕8D條件下，在養蟲籠（60目紗網，0.5m×0.5m×0.5m）內放入異色瓢蟲集中飼養，籠內放置帶有足量豆蚜（）的蠶豆苗，待取食一段時間后更換一盆新的含足量蚜蟲的蠶豆苗。折疊的紙條放入養蟲籠內，作為異色瓢蟲產卵的基質。待雌蟲產卵后，將含有新鮮卵塊的蠶豆苗葉或紙條放入塑料培養皿，直至蟲卵孵化后轉移至養蟲籠繼續飼養，繁殖3代后的異色瓢蟲用于試驗。異色瓢蟲越冬種群：2014年10月初直接采于中國黑龍江省帽兒山。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器與設備 移液器（德國Eppendorf公司）、冰箱（海爾BCD-290W）、-80℃冰箱（艾本德U410-86）、恒溫水浴鍋（上海精宏DK-8D）、無菌超凈工作臺（ESCO）、臺式高速離心機（Sigma 1-14）、Eppendorf5424型常溫離心機（德國Eppendorf公司）、電子分析天平（梅特勒-托利多AL204）、AG22331型PCR儀（德國Eppendorf公司）、實時熒光定量PCR 儀（BioRAD CFX96）、電泳儀和電泳槽（北京六一儀器廠）、DNP-9272恒溫培養箱（上海精密實驗設備公司）、NanoDropTM2000微量測定分光光度計（美國Thermo Scientific公司）、5T4100-1106型紫外凝膠成像系統（美國Tanon公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO MLS-3750）。

1.2.2 主要試劑與藥品 DNA Marker DL2000、6×Loading buffer、cDNA一鏈反轉錄試劑盒、T載體等購自大連Takara公司；RNA抽提Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR引物合成和測序由上海Invitrogen公司完成；瓊脂糖購自Sigma公司、實時熒光定量PCR試劑盒和八連管等均購自美國Bio-RAD公司；質粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒購買于德國Omega公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、EDTA 均購自杭州米克化工有限公司；DEPC水、氨芐卡那霉素、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂、甘油等常規試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA抽提及一鏈cDNA合成 用Trizol法提取異色瓢蟲整蟲的總RNA后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度及降解情況，再用微量核酸測定儀測定RNA的濃度。在反轉錄反應中，取1 μg總RNA作為模板，根據反轉錄試劑盒說明書來完成試驗。

1.3.2 sHSP全長序列驗證 從公司測序得到的異色瓢蟲轉錄組數據庫中，找出與HSP基因相近的序列，通過比對找出3條小分子熱激蛋白序列。將這些基因序列翻譯成蛋白序列并在NCBI庫中進行比對，發現這些序列包含完整的cDNA開放閱讀框序列。根據已得的序列，分別從兩端設計特異性引物（表1），進行PCR擴增。具體PCR條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個循環，72℃充分延伸5 min。反應結束，取5 μL PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。當檢測到目的條帶后，將目的片段回收純化，再進行T克隆并連接到T載體中，而后進行菌落PCR驗證，送往上海Invitrogen公司測序。

1.3.3 sHSP基因引物設計 以為內參基因[16]。根據轉錄組測得的基因序列，利用DNAstar和Perimer 5.0軟件設計rp49及3個sHSP基因的特異性引物。

表1 試驗中所用引物

1.3.4 不同發育階段異色瓢蟲sHSP基因的表達 選取實驗種群異色瓢蟲作為試驗材料。不同發育階段包括第1—4天4齡幼蟲、預蛹期、第1—3天蛹期及第1—3天成蟲期（蛻皮或羽化2 h后）。根據異色瓢蟲sHSP基因序列以及基因序列設計qRT-PCR特異性檢測引物（表1）。每個處理隨機抽取3頭且每個處理組重復3次，用紫外凝膠電泳檢測RNA純度，用微量測定分光度計測定RNA濃度，取1 μg總RNA進行反轉錄反應。取1 μl反轉錄產物用于qRT-PCR，每個樣品重復3次。具體熒光定量PCR程序：94℃預變性5 min，94℃變性15 s，59℃退火30 s，68℃延伸30 s，40個循環，在68℃收集熒光信號[17]。采用2-ΔΔCT法進行數據分析[18]。

1.3.5 短時降溫和短時降溫后恢復處理條件下異色瓢蟲sHSP基因的表達 選取成蟲一周后的實驗種群異色瓢蟲作為試驗材料。短時降溫處理：將異色瓢蟲置于25℃人工智能培養箱存放2 h，之后取出一批試驗材料，而后依次將人工智能培養箱溫度設定為15、10、5、0和-5℃，每個溫度梯度各存放2 h并取出試驗材料。

短時降溫后恢復處理：將異色瓢蟲置于-5℃人工智能培養箱存放2 h，之后取出一批試驗材料，而后依次將人工智能培養箱溫度設定為0、5、10、15和25℃，每個溫度梯度各存放2 h并取出試驗材料。重復上述試驗3次，每個處理隨機選取3頭異色瓢蟲。用電勻漿器充分研磨異色瓢蟲，Trizol法提取總RNA，反轉錄出cDNA并參照1.3.4的方法進行qRT-PCR，測定異色瓢蟲3個sHSP基因的相對表達量，用2-ΔΔCT法進行數據分析。

1.3.6 低溫儲存條件下實驗種群和越冬種群異色瓢蟲sHSP基因的表達 在實驗種群和越冬種群中分別選取黑底色斑雌性（簡稱黑雌）和黃底色斑雌性（簡稱黃雌）成蟲一周后異色瓢蟲作為實驗昆蟲，在4℃冰箱中儲存，分別在0、5、10、15和20 d取材，每個取材時間點隨機選取5—10頭異色瓢蟲，試驗重復3次。用電勻漿器充分研磨試驗昆蟲，Trizol法提取總RNA，反轉錄出cDNA并參照1.3.4的方法進行qRT-PCR，測定異色瓢蟲3個sHSP基因的相對表達量，用2-ΔΔCT法進行定量結果數據分析。

1.4 序列分析及數據統計分析

應用DNAStar軟件尋找目標基因序列開放閱讀框并翻譯成蛋白質，等電點及分子量在線分析網址：http://web.expasy.org/compute_pi/，使用SPSS statistics 20對結果進行比較分析，不同處理組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用Tukey-Kramer HSD分析。圖1—5中不同小寫及大寫字母表示經單因素方差分析，Tukey-Kramer HSD檢驗后存在顯著性差異（＜0.05）。

2 結果

2.1 異色瓢蟲轉錄組測序數據的篩選

從公司測序得到的異色瓢蟲轉錄組數據庫中，找出與HSP基因相近的序列，通過比對找出3條小分子熱激蛋白序列。A：開放閱讀框為1 281 bp，翻譯氨基酸數427個，等電點為5.82，預測蛋白分子量為53.88 kD；B：開放閱讀框為570 bp，翻譯氨基酸數190個，等電點為5.24，預測蛋白分子量為21.53 kD；C：開放閱讀框為576 bp，翻譯氨基酸數192個，等電點為5.86，預測蛋白分子量為21.52 kD。

2.2 不同發育階段異色瓢蟲sHSP基因的相對表達量

異色瓢蟲不同發育階段：4齡第1—4天幼蟲（4.1—4.4）、預蛹（PP）、第1—3天蛹（P1—P3）、第1至3天成蟲（A1—A3），其中以羽化后第3天成蟲（A3）為對照。在蛹期第3天表達量顯著高于對照組（圖1-A）。在成蟲第1天表達量較高，但與對照組無顯著差異（圖1-B）。在4齡幼蟲末期表達量呈上升趨勢，且在4齡幼蟲第4天表達量最高顯著高于對照組（圖1-C）。

2.3 短時降溫和短時降溫后恢復處理條件下異色瓢蟲sHSP基因的相對表達量

在短時降溫處理中，以25℃時的表達量為參照。在0℃和-5℃時表達量與對照組相比顯著上調（圖2-A）。在15—-5℃表達量均顯著低于對照組（圖2-B）。在25℃時表達量最高，在10—-5℃表達量均顯著低于對照組（圖2-C）。

數值代表平均數，柱形圖上的豎線代表標準誤，不同字母表示數據在Tukey’s檢驗中差異顯著（P＜0.05）。下同

圖2 短時降溫條件下實驗種群異色瓢蟲成蟲sHSP基因的相對表達水平

在短時降溫后恢復處理中，以-5℃時基因表達量為參照。在短時升溫處理中表達量無顯著性差異（圖3-A）。在15℃時表達量最高，但與對照組無顯著性差異（圖3-B）。在5℃時表達量最低，在5—15℃表達量呈上升趨勢，但與對照組均無顯著差異（圖3-C）。

2.4 低溫儲存對實驗種群和越冬種群異色瓢蟲sHSP基因的相對表達量的影響

低溫儲存條件下以CK（0 d）為對照。實驗種群：黑雌異色瓢蟲在低溫儲存5 d時表達量最高且顯著高于對照組，黃雌異色瓢蟲在低溫儲存5、10、15 d時的表達量均顯著高于對照組（圖4-A）。黑雌異色瓢蟲在5—15 d低溫儲存條件下表達量呈上升趨勢，且都顯著高于對照組，黃雌瓢蟲在15 d時表達量最高且顯著高于對照組（圖4-B）。黑雌瓢蟲在低溫儲存處理中無顯著性高表達，黃雌瓢蟲在低溫儲存過程中亦無顯著性高表達，且隨著儲存天數的增加表達量呈下降趨勢（圖4-C）。

圖3 短時降溫后恢復處理下實驗種群異色瓢蟲成蟲sHSP基因的相對表達水平

越冬種群：黑雌異色瓢蟲在低溫儲存0—10 d時表達量呈上升趨勢，在10—40 d時表達量呈下降趨勢，但與對照組均無顯著差異，黃雌異色瓢蟲在低溫儲存條件下表達量亦無顯著差異（圖5-A）。黑雌異色瓢蟲在低溫儲存10 d條件下表達量最高，但與對照組無顯著差異，黃雌瓢蟲表達量與對照組亦無顯著差異（圖5-B）。黑雌瓢蟲在低溫儲存處理60 d時表達量最高，且與對照組無顯著差異，黃雌瓢蟲在低溫儲存處理中表達量顯著低于對照組（圖5-C）。

圖4 低溫儲存條件下實驗種群異色瓢蟲成蟲sHSP基因相對表達水平

圖5 低溫儲存條件下越冬種群異色瓢蟲成蟲sHSP基因相對表達水平

3 討論

HSPs是一類重要的分子伴侶，它參與蛋白質折疊和降解、細胞內物質的運輸、靶細胞的活性調節等過程[19]。當生物體細胞發生損害時，蛋白質變性失去原本的空間結構和活性功能。這時產生的HSPs可以促進肽鏈重新折疊盤旋，恢復蛋白質原有的空間結構和生物活性[20]。自RitOssa[21]首次從果蠅中發現HSPs以來，有關HSPs的研究報道已經很多。HSPs具有進化上的保守性，對于生物體具有重要意義，其普遍存在于各種微生物和動植物體內[22-23]。在唐斌等[24]的研究中，將7個具有代表性的昆蟲與異色瓢蟲進行對比分析，發現具有高度保守性，同源性高達81%—90%。異色瓢蟲在蛹期和成蟲期均有高表達，升溫處理中在0℃時顯著性高表達，表達水平在饑餓處理8 h時達到最高，以上結果表明異色瓢蟲在發育階段、升溫處理和饑餓處理中均可能起到作用[25]。此外，生物體沒有受到外界刺激時，HSPs也能發揮相應的作用[26]。

sHSP分子量為15—50 kD[27]，是一個極具多樣性的蛋白質家族，其廣泛分布于微生物、高等動植物中。不同組織有不同數目的sHSP，分子量也有相當大的差異[28]。昆蟲體內的sHSP與昆蟲的生長發育密切相關[14]。研究表明，生物體無論處于正常狀態還是應激狀態，sHSP均有相應的表達[29]。家蠶（）sHSP基因在家蠶正常生長發育過程中均有表達，在高溫條件下，重組蛋白BmHSP24.3能使底物蛋白免受熱刺激脅迫而變性[30]。溫度亦能夠對中華稻蝗（）sHSPs基因的表達產生影響，但是不同溫度處理下各基因的表達模式存在差異[31]。正常狀態下亦存在表達的sHSP，這表明sHSP在沒有外界刺激時也起到一定的作用[28,32]。本研究探索了sHSP在異色瓢蟲不同發育階段的表達量，發現基因在蛹期第3天顯著性高表達，在成蟲期第1天表達量最高，在4齡幼蟲第4天顯著性高表達，這與筆者實驗室前期研究結果較一致[33]。

自然界的許多昆蟲在越冬前經過自然的逐步降溫的過程，低溫脅迫增強了昆蟲的抗寒能力，前人推測在該過程中包括sHSP在內的眾多基因都起到了作用。田怡[34]用不同溫度處理橘小實蠅（）7日齡成蟲，結果表明和的表達量僅在-5℃顯著上調，、和在-5℃和40℃脅迫下均顯著上調；而的相對表達量不會受溫度影響；的相對表達量經-5℃和0℃脅迫后顯著下降；鄔夢靜等[35]研究了異色瓢蟲低溫脅迫下過冷卻點變化及抗寒基因表達，發現異色瓢蟲小分子熱激蛋白高表達以提高其抗寒能力。根據本研究結果，發現短時降溫條件下sHSP基因顯著性高表達，且不同的sHSP可能在降溫脅迫的不同時期發揮作用，與實驗室前期研究結果較一致。經過低溫儲藏處理的異色瓢蟲sHSP的表達量顯著上升，這表明sHSP具有保護異色瓢蟲抵御寒冷的功能[33]。前期試驗結果中異色瓢蟲和在短時降溫后恢復處理過程中顯著性高表達，這表明sHSP在熱激條件下可能發揮著關鍵作用[33]。在本研究短時降溫后恢復處理中，以-5℃時基因表達量為參照，在15℃時表達量最高，但與對照組無顯著性差異（圖3-B），其他基因無顯著性高表達，不同sHSP在短時降溫后恢復處理條件下的作用還有待進一步研究。

在溫帶地區，冬季對于節肢動物來說是一種巨大的環境壓力[36]。研究顯示，冷馴化（特別是0℃和5℃）能顯著提高昆蟲抗寒性[37]。本研究中實驗種群在低溫儲存條件下，黑雌在儲存5—15 d時顯著性高表達，黃雌在儲存5 d時顯著性高表達，黑雌瓢蟲在5—20 d時顯著性高表達，黃雌瓢蟲在15 d時顯著性高表達。黑雌和黃雌瓢蟲表達量均無顯著性差異。越冬種群異色瓢蟲受到自然界氣候馴化，所以越冬種群的耐寒性高于夏季種群。在5℃條件下對夏季種群進行馴化，馴化后的夏季種群存活率與越冬種群存活率相接近[38]。隨著寒冷冬季的到來，越冬種群的異色瓢蟲在生理和行為上都會有所準備，比如滯育，降低機體含水量，降低過冷卻點，積累脂肪，尋找躲避場所等[38]。本研究中的3個sHSP在越冬種群的低溫儲存處理中無顯著性高表達，可能這3個sHSP在異色瓢蟲遭受短時升溫過程中無明顯作用。

異色瓢蟲鞘翅色斑呈現季節性變化規律，這種變異現象可能與保護色有關[39-40]。由可看出實驗種群黑雌和黃雌異色瓢蟲sHSP基因兩者均在第5天顯著性高表達，但表達量和趨勢都有差異（圖4-A）。導致異色瓢蟲色斑呈現多樣性的因素有很多，可能與性交配選擇、避免天敵捕食、不同環境條件下酶活力不同等有關，目前尚無較全面準確的答案，但是所有這些因素都是為了保持種族繁衍而適應環境所作出的改變[8,40-41]。此外，昆蟲冷馴化離不開各種內因和外因。昆蟲冷馴化機制復雜多樣，其具體的抗寒機制和遺傳關系還有待進一步探索。

4 結論

在異色瓢蟲生長發育過程中和均顯著性高表達，且不同的sHSP可能在不同的發育階段發揮作用。在短時降溫處理中，異色瓢蟲顯著性高表達以提高其抗寒能力。在短時降溫恢復處理中，3個sHSP基因無顯著性高表達。低溫儲存條件下實驗種群黃雌和黑雌的均有顯著性高表達，且黃雌和黑雌sHSP基因表達量有所差異。低溫儲存條件下越冬種群無顯著性高表達。綜上可預測異色瓢蟲同一家族sHSP在不同刺激下功能也不盡相同。

References

[1] Koch R L. The multicolored Asian lady beetle,: A review of its biology, uses in biological control, and non-target impacts., 2003, 3: 32.

[2] 王甦, 張潤志, 張帆. 異色瓢蟲生物生態學研究進展. 應用生態學報, 2007, 18(9): 2117-2126.

Wang S, Zhang R Z, Zhang F.. , 2007, 18(9): 2117-2126. (in Chinese)

[3] Lee R E, Denlinger D L.. New York:Chapman and Hall, 1991.

[4] 景曉紅, 康樂. 昆蟲耐寒性研究. 生態學報, 2002, 22(12): 2202-2207.

Jing X H, Kang L. Research progress in insect cold hardiness., 2002, 22(12): 2202-2207. (in Chinese)

[5] 郭海波, 許永玉, 鞠珍, 李明貴. 中華通草蛉成蟲抗寒能力季節性變化. 生態學報, 2006, 26(10): 3238-3244.

Guo H B, Xu Y Y, Ju Z, Li M G. Seasonal changes of cold hardiness of the green lacewing,(Tjeder) (Neuroptera: Chrysopidae)., 2006, 26(10): 3238-3244. (in Chinese)

[6] Watanabe M. Cold tolerance and myo-inositol accumulation in overwintering adults of a lady beetle,(Coleoptera: Coccinellidae)., 2002, 99: 5-9.

[7] Koch R L, Carrillo M A, Venette R C, Cannon C A, Hutchison W D. Cold hardiness of the multicolored Asian lady beetle (Coleoptera: Coccinellidae)., 2004, 33(4): 815-822.

[8] Wang S, Michaud J P, Zhang R, Zhang F, Liu S. Seasonal cycles of assortative mating and reproductive behaviour in polymorphic populations ofin China., 2009, 34(4): 483-494.

[9] Michie L J, Masson A, Ware R L, Jiggins F M. Seasonal phenotypic plasticity: wild ladybirds are darker at cold temperatures., 2011, 25(6): 1259-1268.

[10] Ruan C C, Du W M, Wang X M, Zhang J J, Zang L S. Effect of long-term cold storage on the fitness of pre-wintering(Pallas)., 2012, 57(1): 95-102.

[11] Labrie G, Coderre D, Lucas é. Overwintering strategy of multicolored Asian lady beetle (Coleoptera: Coccinellidae): cold-free space as a factor of invasive success., 2008, 101(5): 860-866.

[12] 唐芬芬, 邵榆嵐, 楊偉克, 楊海, 李平平, 李騰芳, 白興榮. 昆蟲響應非生物脅迫——表達熱休克蛋白策略的研究進展. 中國農學通報, 2013, 29(30): 181-184.

Tang F F, Shao Y L,Yang W K, Yang H, Li P P, Li T F, Bai X R. Advance on insect strategy of expressing heat shock protein to response abiotic stress., 2013, 29(30): 181-184. (in Chinese)

[13] 王國強. 小分子熱休克蛋白生物學功能的研究進展. 安徽農業科學, 2010, 38(19): 9946-9947, 9949.

Wang G Q. Research progress in biology function of small heat shock protein., 2010, 38(19): 9946-9947, 9949. (in Chinese)

[14] 郭虹霞, 王創云, 趙麗, 王陸軍, 王晉, 侯雅靜, 郭晶心. 小分子熱激蛋白的研究進展. 山西農業科學, 2013, 41(12): 1421-1423.

Guo H X, Wang C Y, Zhao L,Wang L J, Wang J, Hou J Y, Guo J X. Research progress of small heat shock protein., 2013, 41(12): 1421-1423. (in Chinese)

[15] 趙靜, 肖達, 李曉莉, 許永玉, 王甦. 異色瓢蟲不同色斑型成蟲的耐寒性研究. 應用昆蟲學報, 2015, 52(2): 428-433.

Zhao J, Xiao D, Li X L, Xu Y Y, Wang S. Cold tolerance of different adult elytral color morphs in(Coleoptera: Coccinellidae)., 2015, 52(2): 428-433. (in Chinese)

[16] Shi Z K, Liu X J, Xu Q Y, Qin Z, Wang S, Zhang F, Wang S G, Tang B. Two novel soluble trehalase genes cloned fromand regulation of the enzyme in a rapid changing temperature., 2016, 198B: 10-18.

[17] 汪慧娟, 施佐堃, 徐風嬌, 沈祺達, 徐燕霞, 王世貴, 唐斌. 異色瓢蟲多巴脫羧酶基因序列及低溫誘導表達分析. 環境昆蟲學報, 2016, 38(2): 271-279.

Wang H J, Shi Z K, Xu F J, Shen Q D, Xu Y X, Wang S G, Tang B. Gene sequence and expression analysis of Dopa decarboxylase inunder low temperature induction., 2016, 38(2): 271-279. (in Chinese)

[18] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[19] 黃惠芳, 馬飛. 熱激蛋白的分子進化研究. 廈門大學學報(自然科學版), 2004, 43(增刊):166-170.

Huang H F, Ma F. The molecular evolution of heat shock proteins., 2004, 43(Suppl.): 166-170. (in Chinese)

[20] Moseley P L. Heat shock proteins and heat adaption of the whole organism., 1997, 83(5): 1413-1417.

[21] Ritossa F M. Experimental activation of specific loci in polytene chromosomes of., 1964, 35(3): 601-607.

[22] 唐斌, 林青青, 鄔夢靜, 施興榮, 王世貴. 抗寒類蛋白與冷馴化誘發昆蟲耐寒的生理調節研究. 環境昆蟲學報, 2014, 36(5): 805-813.

Tang B, Lin Q Q, Wu M J, Shi X R, Wang S G. The physiological regulation of hardy proteins and induce insect’s cold-resistance by cold acclimation., 2014, 36(5): 805-813. (in Chinese)

[23] 陳莉. 柞蠶熱激蛋白90基因的克隆與表達分析[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2012.

Chen L. Cloning and expression analysis ofgene from Chinese oak silkworm,[D]Hefei: Anhui Agricultural University, 2012. (in Chinese)

[24] 唐斌, 王世貴, 王峰巍, 龐虹, 張帆. 異色瓢蟲的HSP90基因的克隆與特性分析. 中山大學學報(自然科學版), 2010, 49(2): 72-78.

Tang B, Wang S G, Wang F W, Pang H, Zhang F. Cloning and characterization analysis of heat shock protein 90 gene from(Pallas)., 2010, 49(2): 72-78. (in Chinese)

[25] Shen Q D, Zhao L N, Xie G Q, Wei P, Yang M M, Wang S G, Tang B. Cloning three(Coleoptera: Coccinellidae) heat shock protein 70 family genes: regulatory function related to heat and starvation stress., 2015, 50(3): 168-185.

[26] 鄭井元. 松材線蟲()熱激轉錄因子(HSF)的分離及HSP70基因功能的RNAi分析[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2008.

Zheng J Y. Isolated of heat shock transcription factor () and analysis ofby RNAi in[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2008. (in Chinese)

[27] 王瑞嫻, 高瑞娜, 張婷, 趙國棟, 李兵, 衛正國, 沈衛德. 外源物質誘導家蠶小分子熱激蛋白基因HSP19.9的組織表達活性分析. 蠶業科學, 2010, 36(5): 780-784.

Wang R X, Gao R N, Zhang T, Zhao G D, LI B, Wei Z G, Shen W D. An analysis of tissue expression activities ofmolecule heat shock protein geneinduced by exogenous substances., 2010, 36(5): 780-784. (in Chinese)

[28] 李斌, 夏慶友, 藤井博, 伴野豐, 魯成. 低分子量熱激蛋白的進化研究. 蠶業科學, 2004, 30(3): 260-265.

Li B, Xia Q Y, Hiroshi F, Yutaka B, Lu C. Phylogenesis and evolution of small heat shock proteins., 2004, 30(3): 260-265. (in Chinese)

[29] 李顯航, 劉紅美. 家蠅小熱休克蛋白(sHsp20.6)的生物信息學分析. 生物信息學, 2013, 11(1): 65-71.

Li X H, Liu H M. Bioinformatic analysis of small heat shock protein (sHsp20.6) inL, 2013, 11(1): 65-71. (in Chinese)

[30] 劉彬斌. 家蠶低分子量熱激蛋白基因克隆、表達及功能研究[D]. 重慶: 西南大學, 2007.

Liu B B. Study on small heat shock proteins genes in the silkworm,[D]Chongqing: Southwest University, 2007. (in Chinese)

[31] 史學凱, 寇利花, 張育平, 馬恩波, 張建珍, 吳海花. 溫度對中華稻蝗小分子熱休克蛋白基因表達的影響. 應用昆蟲學報, 2016, 53(6): 1267-1273.

Shi X K, Kou L H, Zhang Y P, Ma E B, Zhang J Z, Wu H H. Effects of temperature on the expression patterns ofgenes in,2016, 53(6): 1267-1273. (in Chinese)

[32] 李斌, 夏慶友, 孫衛忠, 魯成, 周澤揚. 昆蟲sHSP基因的系統進化研究. 蠶業科學, 2003, 29(4): 340-343.

Li B, Xia Q Y, Sun W Z, Lu C, Zhou Z Y. Evolution of the small heat-shock proteins in class of insect., 2003, 29(4): 340-343. (in Chinese)

[33] Wang H J, Shi Z K, Shen Q D, Xu C D, Meng Z J, Wang S G, Tang B, Wang S. Molecular cloning and induced expression of six small heat shock protein mediating cold-hardiness in(Coleoptera: Coccinellidae)., 2017, 8: 60.

[34] 田怡. 基于轉錄組數據庫的桔小實蠅sHSP基因的挖掘及功能分析[D]. 重慶: 西南大學, 2015.

TIAN Y. Mining and function analysis of small heat shock protein genes inbased on transcriptome database[D]. Chongqing: Southwest University, 2015. (in Chinese)

[35] 鄔夢靜, 徐青葉, 劉雅, 施興榮, 沈祺達, 楊萌萌, 王世貴, 唐斌. 異色瓢蟲低溫脅迫下過冷卻點變化及抗寒基因表達分析. 中國農業科學, 2016, 49(4): 677-685.

Wu M J, Xu Q Y, Liu Y, Shi X R, Shen Q D, Yang M M, Wang S G, Tang B. The super cooling point change ofunder low temperature stress and its cold-resistance genes’ expression analysis., 2016, 49(4): 677-685. (in Chinese)

[36] Kang L, Chen B, Wei J N, Liu T X. Roles of thermal adaptation and chemical ecology indistribution and control., 2009, 54: 127-145.

[37] Broufas G D, Koveos D S. Rapid cold hardening in the predatory mite()(Acari: Phytoseiidae)., 2001, 47(7): 699-708.

[38] 趙靜, 于令媛, 李敏, 鄭方強, 張帆, 許永玉. 異色瓢蟲成蟲耐寒能力的季節性變化. 昆蟲學報, 2008, 51(12): 1271-1278.

Zhao J, Yu L Y, Li M, Zheng F Q, Zhang F, Xu Y Y. Seasonal variation in cold tolerance of the multicolored ladybeetle,(Pallas) (Coleoptera: Coccinellidae) adults., 2008, 51(12): 1271-1278. (in Chinese)

[39] Wang S, Michaud J P, Tan X L, Zhang F, Guo X J. The aggregation behavior ofin its native range in Northeast China., 2011, 56(2): 193-206.

[40] 談家楨, 胡楷. 異色瓢蟲()鞘翅色斑二個新等位基因和嵌鑲顯性遺傳學說的再證實. 動物學研究, 1980, 1(3): 277-285.

Tan J Z, Hu K. On two new alleles of the color pattern gene in the lady-beetleand further proof of the mosaic dominance theory., 1980, 1(3): 277-285. (in Chinese)

[41] 唐斌, 諸佶, 郭紅雙, 方丹, 沈祺達, 鄭笑笑, 王世貴, 張帆, 王甦. 異色瓢蟲鞘翅色斑變異多樣性研究進展. 杭州師范大學學報(自然科學版), 2012, 11(2): 132-136.

Tang B, Zhu J, Guo H S, Fang D, Shen Q D, Zheng X X, Wang S G, Zhang F, Wang S. Studies of the diversity of multiple elytral color morphs of(Pallas)., 2012, 11(2): 132-136. (in Chinese)

（責任編輯 岳梅）

Sequence analysis and induced expression of three novel small heat shock proteins mediating cold-hardiness in

WANG HuiJuan1, ZHAO Jing2, SHI ZuoKun1, QIU LingYu1,WANG Su3, ZHANG Fan3, WANG ShiGui1, TANG Bin1

(1College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036;2Institue of Plant Diseases and Pests, Weifang University of Science and Technology, Weifang 262700, Shandong;3Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097)

【Objective】is an important predator insect, and it is widely used in agricultural and forestry production. In this study, three small heat shock proteins (sHSP) were screened out and cloned using high throughput sequencing techniques. Also the expression levels of these three sHSP (sHPSs/sHSP genes) were detected under cold stress in order to explore the improvement ofcold resistance role under low temperature stress conditions. 【Method】Based ongene sequences in the transcriptome, several specific primers were designed to obtain the full-length open reading frame (ORF) sequence of the three sHSP genes. The expression of these sHSP genes was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) under short-time cooling or short-time cooling recover conditions, and between the black and yellow females of experimental and overwintering populations under low-temperature storage.【Result】andwere highly expressed at the pupal and adult stages during different developmental stages. And the expression ofin 4th instar larvae on the 4th day was significantly higher than that in control group. In short-term cooling treatment, the expression ofwas significantly higher than that of the control group when the temperature was reduced to 0℃ and -5℃. The expression ofanddecreased significantly during cooling. There was no significant difference in the expression of the three sHSP genes in short-term heating treatment. Theexpression of black female was significantly higher on the 5th day, while the yellow female was significantly higher from the 5th to 15th day in the experimental population under the condition of low temperature storage. The expression ofin black females was significantly higher from the 5th day to 20th day, while in the yellow females was significantly higher on the 15th day. Moreover, there was no significant expression ofblack or yellow female, and,,black females and yellow females were not significantly higher in the low temperature storage treatment in overwintering population. 【Conclusion】sHSP may play a role in developmental stages of.expression increased significantly under short-term cooling conditions, suggesting that sHSP inmay play a key role under low temperature stress. While higherexpressionofandwas found in the experimental population under low temperature storage, which indicated that these two genes played an important role in the cold acclimation. In addition, the expression level of black and yellow females ofwas different, it was speculated that the resistance and mechanism of different colors ofare different.

; small heat shock protein; cold-resistance gene; preservation in low temperature; qRT-PCR; gene expression

2017-03-06；接受日期：2017-04-17

國家重點研發計劃（SQ2017ZY060059）、國家桃產業技術體系（nycytx-31-02）、北京市科技計劃（D171100001617003）、北京市農林科學院科技創新能力建設專項（20170107）、北京市農林科學院青年科研基金（QNJJ201725）、濰坊市科技發展計劃（2016ZJ1113）

汪慧娟，E-mail：whjj_701@163.com。通信作者唐斌，Tel：0571-28865680；E-mail：tbzm611@163.com