中國79個小麥品種（系）抗條銹病評價及基因分子檢測

黃亮，劉太國，肖星芷，屈春艷，劉博，高利，羅培高，陳萬權

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中國79個小麥品種（系）抗條銹病評價及基因分子檢測

黃亮1,2，劉太國1，肖星芷3，屈春艷4，劉博1，高利1，羅培高1,2，陳萬權1

（1中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2四川農業大學農學院，成都 611130；3西南大學植物保護學院，重慶 400715；4山東農業大學作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】了解中國小麥品種的條銹病抗性水平，掌握條銹病抗性基因的分布與利用情況，加強小麥品種的合理應用，促進品種布局與推廣，延長品種使用年限，保障小麥生產安全。【方法】在溫室中采用條銹菌CYR32、CYR33、G22-9、G22-14對中國小麥主產區的79個小麥品種（系）進行苗期抗性鑒定，噴霧接種的幼苗在（10±1）℃的黑暗保溫桶中保濕12—18 h，取出置于白天16—18℃，夜晚14—16℃溫室中，光周期為L﹕D=16 h﹕8 h，15 d后按0—9級分級標準進行調查；在河北廊坊大田中采用條銹菌CYR32、CYR33對79個小麥品種（系）進行成株期抗性鑒定，接種適期為小麥拔節期，接種前3 d灌水確保田間土壤溫度。采用1 g夏孢子﹕300 mL礦物油的條銹菌夏孢子懸浮液噴霧接種誘發行感病品種銘賢169，待礦物油晾干后，噴水并覆塑料薄膜保濕12—16 h，待充分發病后調查病害的普遍率、嚴重度和侵染型，調查兩次，以最高等級作為病情發病的級數；利用小麥抗條銹病基因、、、和易位系的相應分子標記Wmc175F/R、SC200F/R、csLv34 F/R、We173 F/R和AF1/AF4對供試小麥進行分子檢測；結合系譜分析、抗病性鑒定和分子檢測結果分析確定參試小麥品種的抗性基因情況。【結果】在所有的參試小麥品（系）中，苗期對CYR32和CYR33均具有抗性的16份，占20.3%；對條銹菌致病類型G22-9和G22-14均具有抗性的4份，占5.1%；對CYR32、CYR33、G22-9和G22-14這4個小種均具有抗性的4份，占5.1%；成株期對CYR32和CYR33表現中抗及以上水平的24份，占30.4%；對CYR32表現全生育期抗性的12份，占15.2%；對CYR33表現全生育期抗性的16份，占20.3%；對CYR32和CYR33均表現全生育期抗性的11份，占14.0%。苗期對4個菌系均具有抗性并且成株期對CYR32和CYR33表現中抗或以上水平的共4份，占5.1%。結合系譜分析、抗病性鑒定和分子檢測結果得出，供試小麥品種中4份攜帶，占5.1%；8份攜帶，占10.1%；3份攜帶，占3.8%；僅1份攜帶，占1.3%；35份攜帶/，占44.3%；4份攜帶2個抗性基因；遠豐139攜帶、和。【結論】中國主產麥區的79個小麥品種（系）對當前條銹菌流行小種抗性水平普遍較低，/易位系使用率依然較高，在今后的育種工作中應加大、等有效抗性基因的利用，育成多基因聚合的有效持久抗性品種，進一步減少對/易位系的使用。

小麥；小麥條銹病；抗病鑒定；抗病基因；分子檢測

0 引言

【研究意義】小麥條銹病是一種由小麥條銹菌（f. sp.）引起的、發生范圍廣、流行程度大、危害損失重的小麥真菌病害，在病害流行年份可造成小麥減產40%以上甚至絕收。小麥條銹病在全球范圍內均有分布，中國是小麥條銹病發病面積最廣、損失程度最重的國家[1]。1949年以來，先后發生了9次小麥條銹病大流行，對小麥生產造成了重大損失，直接影響口糧安全生產工作。【前人研究進展】條銹病菌變異是引起中國小麥對條銹病抗性喪失的主要原因，目前，選育并合理運用優良抗病品種依然是防治小麥條銹病最經濟、安全、有效的方法[2]，明確小麥品種的抗病性和抗病基因是實現小麥品種合理布局、優化小麥生產結構的關鍵環節和重要前提。條中32號（CYR32）和條中33號（CYR33）小種的出現頻率年度間雖有變化，但仍然是當前優勢生理小種[3-6]，其對條銹病抗病基因、、、、和一些未知的抗性基因不具有毒性[7-8]。2009年，在四川發現了對中國小麥條銹菌鑒別寄主貴農22有毒性的新菌株（代號V26，現稱為G22致病類群），其主要特點是對重要抗條銹病基因和具有聯合毒性[9-10]，導致貴農系、92R系和Moro等主要抗銹性材料抗條銹性“喪失”，并極有可能上升為中國流行小種[4,11]，其中來自小麥品種Moro的抗條銹基因在四川和貴州等地作為有效抗源得到廣泛應用，占四川小麥主栽品種的17.2%[12]和貴州高抗條銹小麥品種的8.3%[13]；來自四倍體圓錐小麥6VS/6AL易位系的抗條銹基因在黃淮海麥區和西南地區尤其依賴，其中黃淮海麥區帶有的小麥品種多達30%[14]，云貴川地區推廣的帶有的云麥52、川麥42、川麥47、川麥38以及綿麥37、綿麥168和貴農21、貴農775等品種均有廣泛應用。采用基因推導和分子標記相結合的方式進行抗性基因的確定可大大提高研究的可靠性和準確性[15]。【本研究切入點】新小種的產生為小麥條銹病防治工作帶來了嚴峻的挑戰，可能引起小麥生產品種的再一次更替，而目前中國主產區小麥品種對新小種的抗性表現和主效基因還有待明確。【擬解決的關鍵問題】通過對79份小麥生產品種（系）所含的抗條銹基因、、、和攜帶的/易位系進行分子檢測并結合系譜分析和抗性鑒定結果，分析中國當前小麥生產品種的抗條銹基因分布情況，為新形勢下小麥品種合理布局和品種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種CYR32、CYR33、G22-9、G22-14由中國農業科學院植物保護研究所麥類病害組收集、鑒定、繁存。

供試小麥為中國小麥主產區部分小麥品種，共79份，陽性對照材料為Avocet S*6/、Avocet S*6/、Avocet S*6/、Avocet S*6/、Avocet S*6/，陰性對照材料為Avocet S。所有小麥品種均由中國農業科學院植物保護研究所麥類病害組收集、繁存。

1.2 小麥抗條銹病鑒定

1.2.1 苗期鑒定 苗期抗性鑒定于2016年3—6月在中國農業科學院植物保護研究所廊坊科研基地麥類病害組低溫溫室完成。采用72穴的育苗盤種植小麥種子，每穴7—9粒，放于育苗間內待小麥第一片葉完全展開時人工接菌。接種采用劉太國等[10]方法，按照9 mg條銹菌新鮮夏孢子比1 ml礦物油（Soltrol?170）的比例配制混合液，并用噴霧裝置均勻噴灑在小麥葉片上，待礦物油完全晾干后（約4—6 h）放入保濕間，均勻噴上吐溫水（1 ml 2.0%吐溫溶液﹕2 L水）溶液，10℃保濕24 h后取出放于低溫室培養，溫度14—18℃，光照16 h·d-1，培養15 d，待對照品種銘賢169完全發病后調查。調查標準按照0—9級標準[16]進行，即0—6為抗病，7—9為感病。

1.2.2 成株期鑒定 成株期抗性鑒定于2015—2016年在中國農業科學院植物保護研究所廊坊科研基地完成。每個品種種植一行，每行長1 m，行距0.33 m，每隔20個品種種植一行銘賢169，在兩個品種中間垂直于行種植一行銘賢169（銘賢169均作為誘發行），在4月中旬小麥進入返青、拔節期時按照1 g條銹菌新鮮夏孢子﹕300 ml礦物油（Soltrol?170）的比例配制混合液，均勻噴撒在誘發行小麥葉片上，待礦物油完全晾干后，均勻噴上0.05%吐溫20水溶液，覆蓋薄膜保濕過夜，第2天清晨揭去薄膜，10 d灌水一次保持田間濕度利于病菌進行再侵染，于銘賢169充分發病（5月下旬和6月上旬）調查病害的普遍率、嚴重度和侵染型[17]，調查兩次，以最高等級作為病情發病的級數。

1.3 分子標記檢測

分子標記檢測試驗于2016年3—9月在中國農業科學院植物保護研究所麥類病害組實驗室完成。

1.3.1 引物序列、、、和攜帶的/易位系分子檢測引物（表1）均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 小麥抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr18和Yr26的特異性引物序列

1.3.2 小麥基因組提取 待小麥苗長至2—3葉期時取小麥葉片，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，用Nano Drop（ND-1000）測定濃度后稀釋至100 ng·μL-1備用。

1.3.3 PCR檢測 PCR檢測采用25 μL體系，包含12.5 μL? PCR SuperMix，上游引物和下游引物各1 μL（引物濃度為100 ng·μL-1），模板DNA 1 μl，ddH2O 9.5 μL。產物均用2.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測，并在WSE-5200一體式凝膠成像系統上觀察拍照。

2 結果

2.1 小麥抗條銹病鑒定

苗期對CYR32具有抗性（0—6）的小麥18份，占22.8%，不具有抗性（7—9）的61份，占77.2%；對CYR33具有抗性的34份，占43%，不具有抗性的45份，占57%；對G22-9具有抗性的15份，占19%，不具有抗性的64份，占81.0%；對G22-14具有抗性的10份，占12.7%，不具有抗性的69份，占87.3%。成株期對CYR32表現免疫（0）的11份，占14%，表現高抗（R）的12份，占15.2%，表現中抗（MR）的6份，占7.6%，表現中感（MS）的19份，占24.1%，表現高感（S）的31份，占39.2%；對CYR33表現免疫的9份，占11.4%，表現高抗的9份，占11.4%，表現中抗的18份，占22.8%，表現中感的20份，占25.3%，表現高感的23份，占29.1%。其中苗期對CYR32和CYR33均具有抗性的16份，占20.3%；對條銹菌毒性類型G22-9和G22-14均具有抗性的4份，占5.1%；對CYR32、CYR33、G22-9和G22-14這4個小種均具有抗性的4份，占5.1%；成株期對CYR32和CYR33表現中抗及以上水平（0、R、MR）的24份，占30.4%；對CYR32表現全生育期抗性的12份，占15.2%；對CYR33表現全生育期抗性的16份，占20.3%；對CYR32和CYR33均表現全生育期抗性的11份，占14.0%。苗期對4個菌種均具有抗性并且成株期對CYR32和CYR33表現中抗或以上水平的共4份，分別為廊研43、西農889、遠豐139和西農223（表2）。

2.2 小麥抗條銹基因分子檢測

2.2.1/易位系分子檢測 Francis等[19]開發了一個長度為1 500 bp的易位系SCAR顯性標記AF1/4，利用該標記對79份供試小麥進行檢測（表2、圖1），發現石4185、煙農22等共35份材料帶有該標記，占檢測總數的44.3%。

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/Yr9；4：煙農22 Yannong 22；5：科農199 Kenong 199；6：石4185 Shi 4185； 7：西農889 Xinong 889；8：石新616 Shixin 616；9：石新618 Shixin 618；10：小偃216 Xiaoyan 216；11：淮麥16 Huaimai 16； 12：西農9871 Xinong 9871；13：萊州137 Laizhou 137；14：澳大利亞紅麥Red wheat from Australia；15：加拿大超強筋小麥Extra-strong gluten wheat from Canada；16：泰農18 Tainong 18；17：新麥16 Xinmai 16

2.2.2、、、分子檢測 利用共顯性標記Wmc175、SC200、csLv34、We173分別對、、、基因進行分子檢測，并結合系譜分析和抗性鑒定結果發現4份材料帶有（表2、圖2），占5.1%；8份材料帶有（表2、圖3），占10.1%；3份材料帶有（表2、圖4），占3.8%；僅1份材料帶有（表2、圖5），占1.3%；4份材料同時攜帶2個抗條銹病基因；1份材料同時攜帶3個抗條銹病基因。

M：DL1000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/Yr5；4：煙農19 Yannong 19；5：魯麥22 Lumai 22；6：濟寧16 Jining 16；7：良星99 Liangxing 99；8：煙農21 Yannong 21；9：廊研43 Langyan 43；10：山農15 Shannong 15；11：煙農836 Yannong 836；12：豫麥49 Yumai 49；13：豫麥54 Yumai 54；14：西農889 Xinong 889；15：西農223 Xinong 223；16：遠豐139 Yuanfeng 139；17：石54 Shi 54

表2 79份小麥品種（系）對中國條銹菌主要流行小種的抗病性及抗性基因分子檢測

“+”：存在Present；“-”：不存在Absent

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/Yr10；4：泰山21 Taishan 21；5：淄麥12 Zimai 12；6：河農4198 Henong 4198；7：煙農19 Yannong 19；8：良星 99 Liangxing 99；9：山農17 Shannong 17；10：煙農836 Yannong 836；11：煙9102 Yan 9102；12：臨抗16 Linkang 16；13：臨優145 Linyou 145；14：西農889 Xinong 889；15：豫麥49 Yumai 49；16：豫麥54 Yumai 54；17：小偃216 Xiaoyan 216

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/Yr18；4：河農4198 Henong 4198；5：西農223 Xinong 223；6：臨優145 Linyou145；7：臨旱 822 Linhan 822；8：泰農18 Tainong 18；9：澳大利亞紅麥Red wheat from Australia；10：石54 Shi 54；11：山農1186 Shannong 1186；12：晉麥33 Jinmai 33；13：加拿大超強筋脈Extra-strong gluten wheat from Canada；14：魯麥22 Lumai 22；15：濟麥22 Jimai 22； 16：煙99102 Yan 99102；17：煙農836 Yannong 836

3 討論

近年來分子標記輔助育種在小麥條銹病抗性遺傳改良領域取得了廣泛進展，對于實現多個抗性基因的聚合具有顯著作用。研究表明即使所用分子標記與目標基因的遺傳距離為10 cM，其檢測準確率依然能夠達到90%以上[23]，本研究利用特異性分子標記，輔以分生理小種抗條銹病鑒定和系譜分析確定供試小麥抗條銹病基因的方法可以大大提高結果的可靠性與準確性。供試材料良星99和石麥15號分子檢測結果與張玉薇等[24]的研究結果一致，雖然石麥15號苗期對CYR32、CYR33具有抗性而對G22-9和G22-14不具抗病性，有可能攜帶或，但分子檢測并沒有發現這兩個基因的分子標記，且成株期該品種對CYR32和CYR33兩個條銹菌小種均沒有抗性，所以其抗性可能是由其他基因控制，不攜帶和兩個基因，雖然在系譜分析時發現石麥15號具有“92R系”的血統，但是根據分子檢測和抗性鑒定的結果，推測該品種的抗性基因可能在育種過程中丟失。

M：DL2000；1：ddH2O；2：Avocet S；3：Avocet S*6/Yr26；4：魯麥21 Lumai 21；5：濟麥20 Jimai 20；6：煙農19 Yannong 19；7：魯麥22 Lumai 22；8：濟寧16 Jining 16；9：煙農21 Yannong 21；10：煙農836 Yannong 836；11：煙農0428 Yannong 0428；12：遠豐139 Yuanfeng 139；13：煙99102 Yan 99102；14：豫麥49 Yumai 49；15：豫麥54 Yumai 54；16：淮麥16 Huaimai 16；17：臨旱822 Linhan 822

3.1/易位系分子檢測

易位系是由位于黑麥染色體上的特異性片段通過染色體代換或易位轉移到普通小麥染色體上形成的，于1965年和1970年分兩次引入中國，兼具抗條銹基因、抗白粉基因、抗葉銹基因以及抗稈銹基因，且具有很好的豐產性，所以在當時深受育種工作者的喜愛并將其大范圍應用于小麥育種中[25]。大量的使用導致中國多數小麥品種帶有該易位系，張玉薇等的研究結果均證實中國的小麥種質中/易位系攜帶量在33%以上[24,26-27]，本研究參試品種中/易位系占44.3%。其中，煙農22具有洛夫林13的遺傳背景，其/易位系可能來自于洛夫林13；漯珍1號和周黑麥1號都具有山前麥的遺傳背景，其/易位系可能來自于山前麥；石麥15號和石家莊8號都具有阿夫樂爾和洛夫林10的遺傳背景，其/易位系可能來自于阿芙樂爾或洛夫林10；石麥18號、科農199、石4185都具有洛夫林10的遺傳背景，它們的/易位系可能來自洛夫林10；洛旱21號、洛旱24號都具有矮孟牛的遺傳背景，它們的/易位系可能來自矮孟牛。然而，由于/易位系上的基因控制的黑麥堿表達以及蛋白質質量降低等原因導致面筋強度減弱、面團發黏、耐揉性差等使小麥加工品質變劣的特點[28-30]，已不符合當前對高品質面粉需求，因此應進一步減少/易位系在中國小麥育種中的應用，對已育成的小麥品種可通過對/易位系上劣質基因的改良達到優化品種的目的。

3.2 攜帶、、、的材料

至2016年，全球共正式定名了76個條銹病抗病基因（—）[31]，然而多數抗病基因都具有小種專化性，目前對中國流行小種CYR32和CYR33均具有抗病性的抗條銹基因僅有、、、以及等少數基因[32]。G22毒性類群的出現使和喪失抗性，導致中國小麥生產再次受到條銹病的威脅，及時調整育種思路和策略，尋找開發新抗源，盡量延長已有品種的使用年限，是應對挑戰的合理途徑。

本研究對全國79份小麥品種（系）進行分子檢測，發現其中臨優145、新麥26、濟南17雖然能夠檢測到的分子標記，但是它們對G22-14均沒有抗性，且系譜分析也不具有遺傳背景，所以認為它們不攜帶，原因可能是由于在非分離群體中利用分子標記進行篩選時，在不具有抗性基因的材料中檢測到標記基因的概率會更大[33]；而臨優145和新麥26均對CYR32和CYR33表現全生育期抗性，分子檢測發現它們帶有分子標記，系譜分析發現這兩個品種均有陜優225的遺傳背景，所以推測該抗性基因來源于陜優225[34]；濟南17也表現出對CYR32、CYR33、G22-9的抗性，其抗性基因可能來自于遺傳背景較復雜的魯麥13。西農889和遠豐139兩個品種均抗所有小種且分子檢測帶有基因標記，系譜分析發現它們均為小偃6號的后代，但小偃6號苗期不抗CYR32，所以它們的抗性基因可能來自于其他親本。西農223也對所有小種具有抗性，其苗期抗性主要由決定，成株期抗性主要由和共同決定，該結果與李敏州等[27]的研究一致。泰山21、河農4198對CYR32和CYR33表現全生育期抗性而對G22-9和G22-14不具抗性，且分子檢測表明它們均帶有標記，系譜分析泰山21具有魯麥18的遺傳背景，所以其抗性基因可能來自于魯麥18；河農4198具有河農326的遺傳背景，所以其抗性基因可能來自于河農326。澳大利亞紅麥、加拿大超強筋麥均為國外引進品種，并具有成株抗條銹病基因，是優良的育種材料。

4 結論

中國小麥主栽品種對當前條銹菌流行小種抗性水平普遍較低，/易位系出現頻率達44.3%；有效基因和使用率分別為5.1%和3.8%，出現頻率為10.1%，僅遠豐139檢測到。盡管如此，G22-9和G22-14對和具有聯合毒性，在今后的小麥育種工作中應注意減少對和的依賴，聚合多種抗條銹病基因，倡導利用成株抗條銹病基因。對已育成的品種，如本文提到的遠豐139、臨抗16號、淄麥12、河農4198、泰山21等應加以改良，培育出兼抗多種病害的品種，保障小麥的生產安全。

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（責任編輯 岳梅）

Evaluation of stripe rust resistance and molecular detection ofgenes of 79 wheat varieties (lines) in China

Huang Liang1, 2, Liu Taiguo1, Xiao Xingzhi3, Qu Chunyan4, Liu Bo1, Gao Li1, Luo Peigao1,2, Chen Wanquan1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;3College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715;4State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【Objective】The objectives of this study are to understand the resistance toof wheat cultivars and the distribution and application ofgenes in the main wheat growing regions, to give some suggestions for the farmers and governors when they choose cultivars, and to prolong the planting years of cultivars based on the harboredgenes. 【Method】 There were four races, designating CYR32, CYR33, G22-9 and G22-14 used to identify stripe rust resistance of 79 wheat cultivars or lines from main wheat producing areas in China at seedling stage in greenhouse. The seedlings were put into barrels for keeping humidity in dark for 12-18 h at (10±1)℃ after inoculation, then they were put into greenhouse at 16 to 18℃ in the day time and 14 to 16℃ in the nighttime with 16 hours’ light and 8 hour’s darkness. The investigation was carried out 15 days after inoculation as 0-9 scales. And CYR32 and CYR33 were used for further resistance evaluation at the adult stage at Langfang Station of Hebei Province. In order to keep soil humidity, enough water should be irrigated before the inoculation of adult plants was carried out at jointing stage. The urediniospore suspensions were adjusted to 1 g urediniospores﹕300 mL mineral oil and sprayed the susceptible control cv. Mingxian 169. After the mineral oil evaporated thoroughly, the plants were sprayed water by hand-hold sprayer and covered with plastic film for 12-16 h for keeping moisture. The incidence, severity and infection type were recorded at least twice to keep the severer records as the final data. Then the authors screened these wheat cultivars with the closely linked molecular markers of wheat stripe rust resistance genes(Wmc175F/R),(SC200F/R),(csLv34 F/R),(We173) and(AF1/AF4) translocation lines. With all data were integrated, such as pedigree of cultivars (lines), resistance to the 4 races, and molecular detection, the yellow rust resistance genes were postulated. 【Result】Among all tested cultivars or lines at seedling stage, 16 (20.3%) were resistant to CYR32 and CYR33, 4 (5.1%) were resistant to G22-9 and G22-14, only 4 (5.1%) cultivars showed resistance to 4 races off. sp.(). However, there were 24 (30.4%) showed resistance to CYR32 and CYR33 at adult stage. As for wheat cultivars at all growth stages, 12 (15.2%) were resistant to CYR32, 16 (20.3%) were resistant to CYR33 and only 11 (14.0%) were resistant to both CYR32 and CYR33. Only 4 (5.1%) cultivars showed resistance to CYR32, CYR33, G22-9 and G22-14 at seedling stage and CYR32 and CYR33 at adult stage, respectively. After all the information integrated, such as pedigree of cultivars (lines), resistance to the 4 races, and molecular detection, it showed that 4 (5.1%) tested cultivars contained, 8 (10.1%) contained, 3 (3.8%) contained, 1 (1.3%) contained, 35 (44.3%) contained, and 4 cultivars contained 2genes, and Yuanfeng 139 contained,and.【Conclusion】The 79 cultivars (lines) have low resistance to the prevalent 4 races and the usage of/translocation line was still high. In the future breeding, the utilization of effective resistance genes such asandshould be increased. Pyramiding multi-gene varieties with effective durable resistance should be strengthened and the use of/translocation line should be decreased.

wheat; wheat stripe rust; resistance evaluation; resistance gene; molecular detection

2017-03-03；接受日期：2017-05-19

國家自然科學基金（31371884，31611130039）、國家重點研發計劃（2016YFD0300705）、國家轉基因重大專項課題（2014ZX0801101B）、現代農業產業技術體系（CARS-3）

黃亮，E-mail：553204236@qq.com。通信作者劉太國，E-mail：tgliu@ippcaas.cn