小鹽芥TsPIP1;1與TsTIP1;1基因增強轉基因水稻耐鹽性

李偉，韓嬌，黃升財，何蕊,3，王冰，程憲國*

（1中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京100081；2山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041000；3沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧沈陽110866）

小鹽芥TsPIP1;1與TsTIP1;1基因增強轉基因水稻耐鹽性

李偉1，韓嬌2，黃升財1，何蕊1,3，王冰1，程憲國1*

（1中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京100081；2山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041000；3沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧沈陽110866）

【目的】為更好地了解植物水通道蛋白鹽脅迫下的調節作用，對小鹽芥質膜內在蛋白TsPIP1;1及液泡膜內在蛋白TsTIP1;1在轉基因水稻中的鹽脅迫生理響應機制進行探究，旨在為水通道蛋白在耐鹽作物分子改良育種中的應用提供理論支撐。【方法】以野生型(WT)與T3代轉TsPIP1;1及TsTIP1;1基因水稻為材料，進行了水培試驗，并設置了0、100、200mmol/L NaCl處理。處理一周后，分別測定水稻的光合參數、株高、生物量、相對含水量、失水率及鉀、鈉含量。【結果】在鹽脅迫處理下，與野生型相比，轉基因水稻的生物量和含水量明顯增加，滲透勢和失水率顯著降低。轉TsPIP1;1及TsTIP1;1基因水稻根部及地上部的Na+含量都顯著降低，K+在轉基因株系中的累積顯著高于野生型，降低了體內Na+/K+比，并且能夠保持更強的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率及水分利用效率。在200mmol/L NaCl處理下，與野生型相比，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的株高分別高出8.2%、11.6%、4.9%；單株干重分別高出17.9%、23.9%、16.9%；地上部Na+/K+比分別降低24.3%、24.4%、24.8%；根部Na+/K+比分別降低29.6%、27.5%、32.4%；滲透勢分別顯著降低了18.3%、19.4%、30.3%；相對含水量分別增加了5.8%、5.5%、5.4%；凈光合速率分別增加了50.4%、78.5%、56.2%。【結論】TsPIP1;1及TsTIP1;1增強了轉基因水稻的光合呼吸作用，通過降低植物體內Na+/K+比，參與植物細胞的滲透調節，提高了細胞持水能力，促進轉基因水稻的生長發育，增強了水稻的耐鹽性。

轉基因水稻；鹽脅迫；水通道蛋白；滲透調節

水分在植物各器官中的運輸與分布在植物生長發育過程中發揮著重要的作用。非生物脅迫如干旱、鹽害等會導致植物失水，嚴重限制了植物的生長和產量[1]。在干旱和高鹽脅迫下，水分的高效率運輸是維持植物正常生長的重要條件[2–4]。植物體內的水分運輸通常是通過質外體和共質體途徑調控完成的[1]。在非生物脅迫下，植物體通過共質體途徑高效快速地調節水分的跨膜運輸[5–7]，而共質體途徑主要是由水通道蛋白調控的[8]。

根據基因結構及其分布特征將水通道蛋白分為4類：質膜內在蛋白(PIPs)、液泡膜內在蛋白(TIPs)、NOD26-like內在蛋白(NIPs)及小分子內在蛋白(SIPs)，其中對質膜內在蛋白及液泡膜內在蛋白研究較多[9–10]。非生物脅迫下，水通道蛋白通過調控植物多種生物過程，包括水分運輸、細胞伸長與分化、氣孔開閉、滲透調節等[11–12]有效提高植物的抗逆性。TaAQP8的過表達能夠促進鹽脅迫下根的伸長[13]。NtAQP1能夠提高鹽脅迫下煙草的水分利用效率、滲透系數和產量[14]。鹽脅迫下，OsPIP1;1的過表達大大提高了水稻根的導水性，進而增強抗鹽性[15]。同樣，TdPIP1基因在煙草中的過表達促進了根的生長，增大了葉片面積，提高了煙草的抗逆性[16]。TIPs參與細胞質和液泡之間的水分交換，降低細胞質的滲透波動[17]。Beebo等研究結果表明敲除AtTIP1;1的擬南芥雖能正常生長，但其對滲透脅迫敏感[18]。

小鹽芥是一種生長于濱海鹽漬土上的典型鹽生植物，具有極強的耐鹽能力。本研究從小鹽芥中克隆了水通道蛋白質膜內在蛋白TsPIP1;1基因及液泡膜內在蛋白TsTIP1;1基因，并分別構建到植物表達載體轉化水稻，通過鹽脅迫處理轉基因水稻，明確小鹽芥水通道蛋白基因TsPIP1;1及TsTIP1;1參與轉基因水稻的光合作用參數及滲透調節的生理應答效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用RT-PCR基因克隆技術獲得小鹽芥TsPIP1;1與TsTIP1;1完整cDNA序列，命名TsPIP1;1 (accession No:JX133234.1)與TsTIP1;1基因(accession No:JX133236)，將其分別構建植物表達載體pCAMBIA1304與pCAMBIA1307，并轉化水稻，經連續3年檢測獲得穩定遺傳的T3轉TsPIP1;1基因水稻與轉TsTIP1;1基因水稻。

水稻品種：野生型日本Kitaake水稻；T3代轉TsPIP1;1基因水稻株系19與轉TsTIP1;1基因水稻株系5和7。

1.2 試驗設計

水培鹽脅迫試驗于2016年8月在中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所溫室進行，白天室內溫度為25～35℃，光合有效輻射為1000～1600 μmol/(m2·s)左右。

將水稻種子放入裝有蒸餾水的培養皿中，于30℃的培養箱恒溫培養發芽，3天后將已經發芽的水稻幼苗，移栽于長40cm、寬25cm、高20cm的水培箱中，幼苗在1/2Hoagland營養液中正常培養，pH值為5.5±0.5，3d更換一次營養液，培養14d后，以正常Hoagland營養液為基礎，分別進行0、100、200mmol/L NaCl脅迫處理，處理一周后分別測定正常和鹽脅迫下水稻的光合參數、株高及生物量、相對含水量及失水率、滲透勢、Na+和K+含量。1.2.1光合參數的測定在水稻鹽處理后的第7天的9：00～11：30時間段內，使用便攜式光合測定儀Li-6400XT分別測定各處理水稻頂部的第一片完全展開葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰作用(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。水分利用效率(WUE)是Pn與Tr的比值。測定時的光量子密度為1200μmol/(m2·s)，參比室CO2濃度為(400±10)μmol/mol，每個處理測定3株。

1.2.2 相對含水量及失水率的測定將水培鹽處理水稻取樣后，立即稱得鮮重(mf)后，將其置于清水中，過夜，使葉片充分吸水達到飽和狀態，取出葉片，稱重(ms)，將水稻放置于室內，使其自然脫水，每隔1小時對其進行稱重(m1，m2，……，mn)。處理7小時后重量不再改變后，將水稻放入80℃烘箱中烘干至恒重(md)。相對含水量為(mf–md)/(ms–md)× 100%，脫水1小時的失水率為(ms–mn)/ms×100%，以此類推，以脫水時間為橫坐標，失水率為縱坐標觀察野生型與各轉基因株系的失水情況。

1.2.3 滲透勢的測定將水培樣品取樣后迅速放入–80℃超低溫冰箱中，冷凍3小時后，將樣品剪碎，放入注射器中，將細胞液擠壓出存于2mL EP管中，使用Wescor5520露點滲透壓儀測定水稻組織滲透勢。

1.2.4 鈉、鉀含量的測定將樣品的地上部與根分開，105℃殺青30min后，80℃恒溫烘干至恒重，用震蕩粉碎機充分粉碎后，過1mm篩備用。稱取0.2g樣品，用H2SO4–H2O2消煮，火焰光度計測定鈉、鉀含量。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel2007和SPSS軟件進行試驗數據的處理及相關分析，用LSD法即最小顯著差數法對不同處理的結果進行顯著性檢驗。

表1 野生型與轉基因水稻在不同鹽處理下的株高、鮮重和干重Table 1 Shoot height, plant fresh and dry weight of the wild type and transgenic rice lines under different salt treatments

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對水稻生長狀況的影響

野生型與轉基因水稻的株高及生物量在鹽脅迫下顯著降低，隨著NaCl濃度的增加，下降的幅度也顯著增加，并且野生型下降的程度大于轉基因水稻。由表1看出，正常條件下轉基因水稻的株高、單株鮮重與單株干重與野生型并沒有顯著差異。在100mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7和TsPIP-19株系的株高、單株鮮重與干重都高于野生型，但TsPIP-19株系與野生型沒有顯著差異。在200mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的株高比野生型分別高出8.2%、11.6%、4.9%；單株鮮重比野生型分別高出17.1%、19.1%、13.9%；單株干重比野生型分別高出17.9%、23.9%、16.9%。鹽脅迫條件下，轉基因水稻特別是轉TsTIP;1水稻較野生型的生長速率更快，從而使株高和單株鮮干重都顯著地高于野生型。

2.2 鹽脅迫對水稻 Na+、K+含量及 Na+/K+比的影響

正常條件下，轉基因水稻地上部及根中的Na+、K+含量及Na+/K+比與野生型并沒有顯著性的差異。鹽脅迫顯著增加了野生型與轉基因水稻的地上部及根中Na+含量及Na+/K+比，降低了K+含量，并且野生型變化程度大于轉基因水稻。在100mmol/L NaCl處理下，與野生型相比，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的地上部Na+含量分別降低了10.8%、8.8%、9.9%，K+含量分別提高了6.1%、6.8%、7.1%，Na+/K+比分別降低了15.88%、14.53%、15.79%。在100mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的根部Na+含量比野生型分別降低了8.8%、8.7%、15.4%，K+含量比野生型分別提高了26.6%、27.2%、26.9%，Na+/K+比分別比野生型降低了27.9%、28.2%、33.2%(表2)。200mmol/L NaCl處理下，轉基因水稻中鈉和鉀含量的變化表現出相似的變化規律，地上部Na+/K+比分別降低24.3%、24.4%、24.8%；根Na+/K+比分別降低29.6%、27.5%、32.4%。鹽脅迫下轉基因水稻通過降低體內Na+的含量并積累更多的K+維持植物體內的離子平衡，減輕Na+對植物體的毒害作用，并降低轉基因水稻的Na+/K+比，增強了轉基因水稻的耐鹽脅迫的能力。

表2 野生型與轉基因水稻在不同鹽脅迫下的 Na+、K+含量及 Na+/K+比Table 2 Contents of Na+and K+and Na+/K+ratio in the wild types and transgenic rice lines under different salt treatments

2.3 鹽脅迫對水稻滲透勢、相對含水量及失水率的影響

從圖1可以看出，在正常條件下，轉基因水稻和野生型的滲透勢及相對含水量并沒有顯著差異，4個水稻的滲透勢和相對含水量隨NaCl濃度的增加都呈下降趨勢，在100mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的滲透勢比野生型分別降低了19.0%、16.2%、22.2%，相對含水量比野生型分別增加了5.1%、4.3%、4.0%，都達到了顯著水平(P≤0.05)。在200mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的滲透勢比野生型分別顯著降低了18.3%、 19.4%、30.3%，其中TsPIP-19達到了極顯著水平(P≤0.01)，相對含水量比野生型分別增加了5.8%、5.5%、5.4%，三者均達到極顯著水平。在100mmol/L NaCl處理下，轉基因水稻和野生型的失水率隨著處理時間的增加而增加，7小時后轉基因水稻增加的幅度顯著低于野生型，分別降低了6.8%、5.1%、5.3%。

2.4 鹽脅迫對水稻光合參數的影響

圖1 野生型與轉基因水稻在不同鹽處理下的滲透勢、相對含水量及失水率Fig. 1 Osmotic potential, relative water content and water loss rate of the wild and transgenic rice lines under different salt treatments

鹽脅迫顯著降低野生型和轉基因水稻的光合參數，包括凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率以及水分利用效率，并且野生型各個光合參數降低的程度顯著大于3種轉基因株系。由表3看出，在100mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的5種光合參數都與野生型具有顯著差異(P≤0.05)，其中TsTIP-7株系增加的幅度最高，分別比野生型提高了17.2%、14.2%、1.7%、7.9%和8.6%，TsTIP-5株系次之，TsPIP-19株系增加的幅度最低，分別比野生型提高了7.1%、5.8%、1.1%、3.0%和4.4%，TsTIP-7與TsPIP-19在凈光合速率、氣孔導度及蒸騰速率上具有顯著差異。在200 mmol/L NaCl處理下，TsTIP-5、TsTIP-7及TsPIP-19的5種光合參數降低的程度遠小于野生型，達到顯著水平，其中TsTIP-7株系的的光合參數最高，分別比野生型增加了78.5%、84.1%、14.4%、31.9%和35.4%；TsTIP-5增加了50.4%、49.7%、10.8%、14.7%和31.4%；TsPIP-19增加56.2%、55.6%、10.6%、19.8%和0.3%，且TsTIP-7在凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度及蒸騰速率上比TsTIP-5和TsPIP-19顯著增加(P≤0.05)。

3 討論

水通道蛋白(AQP)通過調控體內滲透平衡、水分吸收及轉運、氣孔的開閉及細胞質的離子平衡應對非生物脅迫[19–20]。在高鹽下，植物細胞能夠維持一個較高的K+/Na+比，降低鹽對細胞的傷害，而高K+/Na+比是判斷植物耐鹽性的公認指標[21]。在植物質膜上有許多不同的離子轉運及通道蛋白，例如SOS1、NHX、HKT。在非生物脅迫中，這些蛋白在維持植物體內的離子平衡方面發揮了重要的作用，AtSOS1和SlSOS1作為Na+/H+逆向運輸蛋白能夠通過輸出Na+增強煙草的耐鹽性[22]。在滲透脅迫下，McTIP1;2參與胞內離子的再分布過程維持植物的滲透平衡[23]。本研究結果表明，鹽脅迫下，與野生型相比，轉TsTIP1;1與TsPIP1;1的水稻都能夠降低轉基因水稻根和地上部的Na+含量，提高K+的含量。前人的研究表明，水通道蛋白的超表達能夠提高鹽脅迫下植物體內的K+/Na+比，如在轉基因擬南芥中，TaNIP的超表達會使K+含量更高，Na+的含量更低[12]。TaAQP8超表達的轉基因煙草莖中也表現出相似的鈉、鉀含量分布規律[13]。本研究表明，鹽脅迫下，與野生型相比，轉TsTIP1;1與TsPIP1;1的水稻能夠減少體內Na+的累積，增加K+的吸收，致使Na+/K+比顯著降低，增強植物的耐鹽能力。

鹽脅迫中，植物的保水力對于其生存生長至關重要，水通道蛋白能夠促進水分的快速運輸，維持細胞內水分的平衡穩定。徐娜等[24]證明，在鹽脅迫下，轉SlMIP基因的擬南芥通過增加脯氨酸等滲透調節物質的含量，提高細胞液的濃度，降低滲透勢，增強了細胞的吸水能力。徐毅等[25]研究發現，MaPIP1;1的超表達能夠使轉基因擬南芥的失水率降低，提高植物的保水率，脯氨酸及可溶性糖的含量顯著增加。這些結果表明MaPIP1;1參與植物體內的滲透調節。本研究結果表明，鹽脅迫下，與野生型時相比，轉TsTIP1;1與TsPIP1;1基因水稻能夠降低滲透勢以提高自身的相對含水量，減少失水速率，具有較強的滲透調節能力，通過維持體內水分平衡以適應鹽脅迫。

鹽脅迫會使植物水分的傳導速度迅速下降，導致氣孔關閉，蒸騰速率下降，同時也會使植物的光合速率降低，植物生長速度減緩，產量下降[26]。鹽脅迫能夠降低氣孔和葉肉導度，從而影響葉片中CO2的擴散[27]。水通道蛋白介導的細胞滲透壓的改變，有助于氣孔調節，并調控植物的蒸騰作用，最終促進植物的生長及提高作物產量[28]。Groszmann等研究表明，PIPs能夠通過增加葉肉細胞及保衛細胞膜的透性來運輸CO2，同時增加了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，而1,5-二磷酸核酮糖羧化酶是植物光合作用系統所必需的[29]。在鹽脅迫下，SlTIP2;2的超表達能夠顯著提高植物蒸騰速率、光合速率及水分的利用效率，促進轉基因擬南芥的生長發育[30]。本研究結果表明，鹽脅迫下，與野生型相比，轉TsTIP1;1和TsPIP1;1基因水稻能夠通過顯著減緩氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率及光合速率的下降，促進光合呼吸作用，促進了轉基因水稻的生長發育，顯著增加了生物量，增強了水稻的耐鹽能力。

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Thellungiella salsuginea TsPIP1;1 and TsTIP1;1 enhanced the salt tolerance of transgenic rice

LI Wei1,HAN Jiao2,HUANG Sheng-cai1,HE Rui1,3,WANG Bing1,CHENG Xian-guo1*
(1 Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, CAAS, Beijing 100081, China; 2 College of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen, Shanxi 041000, China; 3 College of Land and Environmental Sciences, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

【Objectives】To better understand the regulatory roles of aquaporins in plants in response to salt stress and provide atheoretical support for the application of aquaporin genes in molecular breeding of salt tolerant crop,two aquaporins of Thellungiella salsuginea,plasma membrane intrinsic protein TsPIP1;1and tonoplast intrinsic protein TsTIP1;1,were investigated by profiling the physiological responses in the transgenic rice under salt stress.【Methods】Wild type(WT)and T3generations of the transgenic rice carrying the TsPIP1;1and TsTIP1;1were subjected to hydroponic solution with0,100and200mmol/L NaCl in greenhouse,respectively.After one-week’s salt treatments,some important physiological parameters such as the photosynthetic rates,plant height,biomass,relative water contents,water loss rates and the contents of Na+and K+were determined.【Results】Under200mmol/L NaCl treatment,compared with the wild type,thetransgenic rice exhibited higher biomass and relative water contents,and lower water loss rates and osmotic potentials,and demonstrated lower contents of Na+and higher contents of K+in roots and shoots and thus leading to lower Na+/K+ratios.The transgenic rice maintained stronger net photosynthetic rate,stomatal conductance, transpiration rate and water use efficiency.Compared with the wild type,in200mmol/L NaCl treatment,the shoot heights in the transgenic lines TsTIP-5,TsTIP-7and TsPIP-19were respectively increased by8.2%,11.6% and4.9%,and plant dry weights were increased by17.9%,23.9%and16.9%,while the Na+/K+ratios of shoots were reduced by24.3%,24.4%and24.8%,and the Na+/K+ratios of roots were decreased by29.6%,27.5%and 32.4%.The osmotic potentials were significantly depressed by18.3%,19.4%and30.3%,the relative water contents were increased by5.8%,5.5%and5.4%,and the net photosynthetic rates were increased by50.4%, 78.8%and56.2%.【Conclusions】The transgenic rice of carrying the TsPIP1;1and TsTIP1;1genes had better growth development,and enhanced the salt tolerance by increasing the photosynthesis and respiration,decreasing the Na+/K+ratio,participating in cell osmotic adjustment and improving the water holding capacity in plant cells. Key words: transgenic rice;salt stress;aquaporin;osmotic adjustment

2017–02–27接受日期：2017–03–21

國家重點研發項目（2016YFC0501203）；973項目（2015CB150800）資助。

李偉（1991—），女，山東威海人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理與分子應答研究。E-mail：381063338@qq.com

*通信作者E-mail：chengxianguo@caas.cn