固相萃取-氣相色譜/質譜法同時測定植物油中膽固醇和維生素E

嚴婉盈，冼燕萍，林曉佳，王強，郭燕華，李秀英*

（廣州質量監督檢測研究院，廣東廣州511400）

固相萃取-氣相色譜/質譜法同時測定植物油中膽固醇和維生素E

嚴婉盈，冼燕萍，林曉佳，王強，郭燕華，李秀英*

（廣州質量監督檢測研究院，廣東廣州511400）

建立了固相萃取（SPE）凈化結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）同時檢測植物油中膽固醇和維生素E四種異構體（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚）的分析方法。樣品采用氨基固相萃取小柱提取凈化，洗脫液經DB-5MS色譜柱分離，GC-MS選擇離子監測模式（SIM）測定。實驗表明，膽固醇和維生素E四種異構體在各自濃度范圍內線性關系良好。方法的回收率為83.9%～108.0%，相對標準偏差（RSD）為1.3%～9.3%，膽固醇和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的檢出限分別為0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.0mg/kg、0.8mg/kg。結果表明，該方法結果可靠，可用于日常檢測。

植物油；膽固醇；維生素E；固相萃取；氣相色譜-質譜聯用法

維生素E和膽固醇含量是食用植物油中的重要質量指標，快速、準確地檢測食用植物油中的維生素E和膽固醇含量對鑒定食用植物油產品的質量和營養價值具有積極意義，是食品檢測領域的重要課題。

維生素E（vitam in E，VE）是一種脂溶性維生素，對維持人體正常生理功能起重要作用，能延緩人體衰老，促進性激素分泌，提高生育能力等；此外，維生素E也是一種重要的抗氧化劑，能減緩食品氧化變質。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類8種化合物，其中生物效價較高的4種是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[1]。

而膽固醇（又稱膽甾醇）則是一種環戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇并非是有害物質，它存在于動物體內，是形成動物組織細胞膜、膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料。但過多食用膽固醇會引發高血脂癥，誘發一系列心腦血管疾病，由于食用植物油中一般不含或含有較少量的膽固醇，因此檢測食用植物油中的膽固醇成分可以鑒別產品是否摻雜，是否含有膽固醇含量較高的動物油脂，從而推測食用植物油中是否混有地溝油[2]。

目前，維生素E的檢測方法有比色法、分光光度法、光譜法、電化學法和色譜法，而色譜法又包括氣相色譜法、高效液相色譜法和超臨界色譜法[3-4]，膽固醇的檢測方法有比色法、氣相色譜法、氣相色譜質譜聯用法、高效液相色譜法等[5-8]，但關于維生素E和膽固醇同時檢測的文獻報道甚少，僅有個別文獻介紹采用氣相色譜法同時檢測雞蛋中α-生育酚和膽固醇[9]。由于植物油中膽固醇含量較少，因此需采用適當的富集手段。固相萃取（solid phaseextraction，SPE）是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的[10]。固相萃取作為樣品前處理技術，已廣泛應用于食品、環境等樣品的檢測中[11]。本研究提出用固相萃取法處理食用植物油樣品，氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[12-13]同時檢測樣品中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇[14]。目的是開發出一種簡便快捷且抗干擾能力強的方法，用于同時檢測植物油中的維生素E和膽固醇，對于提高食品日常檢測的效率和可靠度具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油、玉米油、花生油、葵花籽油等食用植物油均購自本地市場；正己烷（色譜純）；丙酮水（98∶2，V/V）混合溶液（色譜純）、維生素E標準品（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚），純度均＞98%：美國Supelco公司；膽固醇標準品（純度99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；弗羅里硅土固相萃取柱（1 g，6m L）、氨基固相萃取柱（1 g，6m L）：CNW Technologies公司；硅膠固相萃取柱（500mg，3m L）：美國phenomenex公司；去離子水（18.2MΩ·cm）：美國M illipore公司。

1.2 儀器與設備

7890A GC-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（配7683自動進樣器）：美國Agilent公司；MS2M inshaker渦旋振蕩器：德國IKA公司；固相萃取裝置：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

準確稱取0.5 g植物油樣品（精確至0.01 g）于10m L具塞試管中，加入約5m L正己烷，加蓋，渦旋分散1min，將全部樣液轉移至氨基固相萃取小柱（使用前用10m L正己烷活化）中，用20m L正己烷淋洗，抽干柱子并棄去以上步驟流出液。用8m L洗脫液（98∶2丙酮和水混合溶液）洗脫，收集于10m L比色管，以上步驟控制柱子流速在1m L/min。然后用洗脫液將收集液定容至10m L，經0.22μm聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）微孔膜過濾，濾液供氣相色譜-質譜聯用儀分析。

1.3.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別精確稱取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇標準品各25mg至25m L棕色容量瓶中，以正己烷定容至刻度，配置成1 000mg/L的單一標準儲備液，4℃冰箱中保存備用。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚使用前按GB/T 5009.82—2003《食品中維生素A和維生素E的測定》進行濃度校正。

混合標準中間液：量取適量α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和膽固醇標準儲備溶液，配制成質量濃度為100mg/L的混合標準中間液。

混合標準工作液：吸取混合標準中間液0.025m L、0.05m L、0.1m L、0.5m L、1.0m L至10m L容量瓶中，用丙酮定容。配制成質量濃度為0.25mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L和10mg/L的系列標準工作溶液。由于維生素標準品易受光照、溫度等環境因素的影響，因此配制過程中要保證避光、現配現用。對于超出曲線范圍的樣品應做適當稀釋使之在線性范圍內再進行測量。

1.3.3 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；載氣為高純度氦氣（純度99.999%），流速1.5m L/m in；進樣口溫度250℃；升溫程序為初始溫度220℃保持5min，然后以10℃/m in升至280℃，保持15m in，再以20℃/m in升至300℃，保持2min，進樣量1μL；不分流進樣。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電離能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；溶劑延遲6m in，采用選擇離子掃描定量。目標物的保留時間、特征離子見表1。

表1 膽固醇和維生素E四種形式的保留時間、特征離子Table 1 Retention time,characteristic ions of cholesteroland four kinds of vitam in E isomers

1.3.4 實驗參數優化方法

以5種目標化合物的回收率為評價指標，分別考察分散溶劑為正己烷、丙酮以及二氯甲烷時，固相萃取柱為弗羅里硅土固相萃取柱、氨基固相萃取柱、硅膠固相萃取柱，淋洗溶劑（正己烷）用量為5～25m L，洗脫溶劑（丙酮水混合溶液）的水百分含量為1.0%～5.0%時，各參數對目標化合物的回收率的影響，確定前處理條件的最優參數；并對色譜柱的類型進行考察，以目標化合物的分離度及響應值作為評價指標，優選出理想的色譜柱。

2 結果與分析

2.1 樣品處理條件的優化

2.1.1 分散溶劑的選擇

植物油樣品黏度較大，上柱前應進行稀釋，選擇與油互溶性良好的有機溶劑（正己烷、丙酮以及二氯甲烷）作為分散劑，比較3種溶劑對加標量為20mg/kg的加標樣品的分散情況及5種目標化合物在氨基固相萃取柱上的回收率，回收率計算結果見表2。

表2 不同分散溶劑對各目標物回收率的影響Table 2 Effect o f different dispersion so lvent on the recovery rate of each target compound

由表2可知，用極性較大的丙酮和二氯甲烷作為分散劑稀釋樣品上柱時，目標物在固相萃取柱上的保留率為22.4%～36.5%，而用正己烷稀釋油樣上柱時，5種目標物回收率達92%以上，因此選擇正己烷作為分散劑對樣品進行稀釋后上柱富集凈化。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

分別使用弗羅里硅土固相萃取柱[15]、氨基固相萃取柱、硅膠固相萃取柱[2]3種正相萃取柱對加標量為20mg/kg的加標樣品進行富集凈化處理，以20m L正己烷淋洗，10m L 98%丙酮水溶液洗脫，比較其凈化回收率。結果如圖1所示，3種固相萃取柱對5種目標化合物的凈化回收率均較好，而氨基柱回收率最接近100%，因此選擇氨基柱作為凈化固相萃取柱。

圖1 不同固相萃取柱凈化回收率比較Fig.1 Comparison of purification recovery rate of different solid phase extraction

2.1.3 淋洗溶劑和洗脫溶劑的考察

選擇氨基固相萃取柱凈化常用的淋洗溶劑正己烷，考察其用量分別為5m L、10m L、15m L、20m L和25m L時對雜質的淋洗效果及回收率，結果見圖2。由圖2可知，淋洗劑用量對回收率的影響不大，但用量20m L以上色譜的總離子流圖顯示雜質較少，因此選擇正己烷淋洗劑用量為20m L。

圖2 樣品的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of samples analysis by GC-MS

氨基固相萃取柱凈化常用極性溶劑作為洗脫液，丙酮是強極性溶劑，能把目標物從固相萃取柱中洗脫出來，加入一定量的水能降低填料對目標物的吸附能力從而更易被洗脫，最終目的是使目標物最大程度隨洗脫液流出。但有文獻實驗表明，含水量過多會使回收率降低[6]，同時由于氣相色譜柱對水僅有一定耐受性，進樣初期水分未能完全揮發可能會損害色譜柱。因此要控制水分的比例。實驗對比了水的含量分別是1.0%、2.0%、3.0%和5.0%的丙酮溶液對5種目標物的洗脫效果，回收率計算結果見圖3。由圖3可知，丙酮中水的百分含量在2%以上時可獲得良好的回收率，為了保護色譜柱，選擇丙酮∶水（98∶2，V/V）作為洗脫溶劑。

圖3 丙酮中水的百分含量對凈化回收率的影響Fig.3 Effect of the percentage ofwater in acetone on purification recovery rate

2.2 色譜條件的優化

本研究的5種目標化合物均是環鏈型結構，極性基團較少，因而極性較弱，因此選擇極性較弱的色譜柱進行分離，考察DB-1MS和HP-5MS毛細管氣相色譜柱對目標物的保留和分離情況[16]，在優化的條件下5種目標化合物的SIM模式下總離子流色譜圖見圖4。

圖4 DB-1 MS（A）和HP-5 MS（B）色譜柱分離5種目標化合物的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chrom atogram s of five target compounds separation by co lumn DB-1 MS(A)and HP-5 MS(B)

由圖4可知，兩種色譜柱對5種目標物均有較好的保留，分離情況良好，但是DB-1MS的保留時間稍長，且HP-5 MS的應用更為廣泛，因此選擇HP-5MS作為分離的色譜柱。

2.3 線性關系、檢出限

在優化條件下，對系列標準溶液進行測定，以標準溶液的質量濃度（x，mg/L）為橫坐標，相應的峰面積（y）為縱坐標，擬合線性方程和相關系數R，結果見表3。

表3 目標物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Tab le 3 Linear equation,correlation coefficient,detection lim it and quantitative lim it of target com pounds

由表3可知，5種目標物在0.25～10mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數R均＞0.999。以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，結合樣品的前處理過程，計算出方法的檢出限為0.2～2.0mg/kg。

2.4 精密度和回收率

選擇大豆油樣品進行了低、中、高3個水平的加標回收實驗，加標量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，每個加標水平平行測定6次，對中間加標水平連續測量5 d，計算方法的回收率和精密度，結果見表4。

表4 回收率與精密度測試結果Table 4 Results of recovery rate and precision tests

由表4可知，5種目標物的平均回收率為83.9%～108.0%，日內精密度相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD，n=6）為1.3%～9.3%，日間精密度（n=5）相對標準偏差（RSD）為5.2%～9.3%，表明該檢測方法具有良好的精密度和準確性。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對從市場購買的10份植物油（大豆油2份、玉米油3份、花生油2份和葵花籽油3份）中膽固醇及維生素E進行分析，結果見表5。

表5 實際樣品檢測結果Table 5 Determ ination results of actualsamples

由表5可知，樣品中均檢出膽固醇，含量為0.41～0.74mg/kg，玉米油和葵花籽油均檢出維生素E，含量范圍為12.9～632mg/kg。

3 結論

本實驗建立了氣相色譜-質譜法同時檢測食用油中膽固醇和四種維生素E含量的方法，樣品中的膽固醇和維生素E經過氨基固相萃取柱凈化提取，用氣相色譜-質譜技術進行分離分析，外標法定量分析，方法的精密度和回收率均滿足實驗檢測要求，檢出限低，與現行國標相比，樣品經過固相萃取柱凈化處理并采用具有強抗干擾能力的氣相色譜-質譜法檢測，有效降低樣品基質對檢測結果的影響；且能同時檢測植物油中兩項重要指標膽固醇和維生素E，更好地滿足日常檢測需要。

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Simultaneousdeterm ination of cholesteroland vitam in E in vegetableoilby solid phase extraction and gas chromatography-massspectrometry

YANWanying,XIAN Yanping,LIN Xiaojia,WANGQiang,GUO Yanhua,LIXiuying*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511400,China)

An analysismethod wasestablished for the simultaneousdetection of cholesteroland four kindsof vitam in E isomers(alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopheroland delta tocopherol)in vegetableoilusing solid phaseextraction(SPE)and gas chromatography-massspectrometry (GC-MS).Sampleswere concentrated and purified by NH2SPE cartridges.The eluentwas separated by DB-5MS capillary chromatographic column and detected by selected ionmonitoring(SIM)modeof GC-MS.Experiments resultsshowed that the cholesteroland four kindsof vitam in E isomers were linear in their respective concentration range.The recovery rate of themethod for target compoundswas83.9%-108.0%.The relative standard deviation(RSD)was1.3%-9.3%.Limits of detection of cholesterol and alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopherol and delta tocopherol were 0.2mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,2.0mg/kg,and 0.8mg/kg,respectively.The results showed that the analysismethod was reliable and can be used for daily inspection.

vegetableoil;cholesterol;vitamin E;solid phaseextraction;GC-MS

TS207.3

0254-5071（2017）08-0168-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.037

2017-03-08

廣東省自然科學基金項目（2016A030310102）

嚴婉盈（1991-），女，助理工程師，本科，研究方向為食品及相關產品質量安全檢測技術。

*通訊作者：李秀英（1984-），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品及相關產品質量安全檢測技術。