灰樹花菌絲體β-葡聚糖提取工藝優(yōu)化

鐘敏，吳天祥，2*，聶文強(qiáng)，蘆紅云

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)明德學(xué)院，貴州貴陽550025）

灰樹花菌絲體β-葡聚糖提取工藝優(yōu)化

鐘敏1，吳天祥1，2*，聶文強(qiáng)1，蘆紅云1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)明德學(xué)院，貴州貴陽550025）

以β-葡聚糖得率為考察指標(biāo)，考察了熱水浸提法、熱水-復(fù)合酶法、超聲波法、超聲波-復(fù)合酶法對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率的影響。影響提取的關(guān)鍵因素為超聲功率、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解溫度，采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，采用超聲波-復(fù)合酶法所得β-葡聚糖得率最大，灰樹花菌絲體β-葡聚糖最佳提取條件為超聲功率300W，超聲時(shí)間15min，復(fù)合酶添加量1.5%，酶解溫度40℃。在此條件下，灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率可達(dá)2.80mg/g。

灰樹花；β-葡聚糖；提取；復(fù)合酶；正交試驗(yàn)

灰樹花（Grifola frondosa）是一種藥食兩用真菌，又名貝葉多孔菌、栗子蘑、千佛菌等，日本稱為舞茸，隸屬于層菌綱、非褶菌目、多孔菌科[1-2]。灰樹花營養(yǎng)豐富，還含有豐富的生物活性物質(zhì)，其主要活性成分是灰樹花多糖。灰樹花多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，按鏈鍵結(jié)構(gòu)可分為α型與β型，其中具有生物活性作用的多糖大多為β構(gòu)型葡聚糖。β-葡聚糖具有抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5]、提高免疫力[6-7]、抗氧化和抗衰老[8-9]以及降血糖降血脂[10]等作用，因此，近年來β-葡聚糖的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

目前，對(duì)于真菌多糖的提取研究較為廣泛，提取工藝也日趨成熟，主要集中在對(duì)總多糖的提取研究上，但以真菌β-葡聚糖為對(duì)象的研究卻鮮有報(bào)道。目前，β-葡聚糖的提取主要有水提、酸堿提、超聲波、微波輔助提取法[11-13]，而采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取灰樹花菌絲體β-葡聚糖的研究未見報(bào)道。因灰樹花中含有的大量纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等非糖類物質(zhì)形成了較為致密的結(jié)構(gòu)而阻礙了多糖的釋放，以相應(yīng)的酶進(jìn)行處理可以降解非多糖物質(zhì)，從而有利于多糖的釋放[14]，同時(shí)再輔以超聲波，β-葡聚糖提取率可大大提高。本課題組前期已對(duì)灰樹花菌絲體多糖及胞外多糖提取工藝做了研究[15-16]。本實(shí)驗(yàn)以灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體為材料，首先比較了4種不同提取方法對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率的影響，以此獲得較優(yōu)的提取方法，在此基礎(chǔ)上通過單因素試驗(yàn)確定了影響提取的關(guān)鍵因素，并采用正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而獲得了最佳提取工藝，以期為β-葡聚糖的規(guī)模化制備提供了一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花（Grifola frondosa）菌株（菌種編號(hào)51616）：中國微生物菌種保藏管理中心；β-葡聚糖：美國Sigma公司；纖維素酶（3U/mg）、果膠酶（40U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶（10萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；剛果紅（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4·12H2O（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；NaH2PO4·2H2O（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏10g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋、GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SG8200HPT型超聲波清洗機(jī)：上海冠特超聲儀器有限公司；TDL-40B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；CP114型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；TS-2102C恒溫振蕩器：上海天呈儀器有限公司；pH計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；UV-1800雙光速紫外可見光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花菌絲體制備

斜面種子培養(yǎng)：用接種鏟從母種試管中挑取黃豆粒大小的菌絲塊于PDA斜面培養(yǎng)基中部，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲體長滿整個(gè)斜面。

液體種子培養(yǎng)：用接種勺從斜面種子培養(yǎng)基中刮取蠶豆粒大小的菌絲體于100m L/250m L液體種子培養(yǎng)基中，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)4～7 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：用移液槍按接種量為10%吸取液體種子培養(yǎng)液于100m L/250m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)7～9 d[17]。

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用8層紗布過濾后獲得菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體，最后將菌絲體置于60℃干燥箱中烘至恒質(zhì)量后，研磨成粉放于干燥器中備用。

1.3.2 β-葡聚糖及總多糖的測定

總多糖的測定采用苯酚-硫酸法[18]，其計(jì)算公式如下：

β-葡聚糖得率的測定采用剛果紅顯色法[19]，計(jì)算公式如下：

1.3.3 不同提取方法基本工藝

稱取一定質(zhì)量的灰樹花菌絲體粉末，加適當(dāng)比例蒸餾水，分別采用熱水浸提法（50℃恒溫水浴鍋中浸提1 h）、超聲波提取法（240W室溫條件下超聲處理0.5 h）、熱水-復(fù)合酶提取法（按菌絲體質(zhì)量的2%添加復(fù)合酶（纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶=2∶1∶2）于50℃恒溫水浴鍋浸提1 h后迅速升溫至90℃滅酶10m in）和超聲波-復(fù)合酶提取法（240W室溫條件下超聲處理0.5 h，然后按菌絲體質(zhì)量的2%添加復(fù)合酶于50℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后迅速升溫至90℃滅酶10m in）后，6 000 r/m in離心20m in，取上清液加4倍體積乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%）4℃醇沉24 h，4 000 r/min離心15m in后得沉淀，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%）清洗沉淀兩次，最后將沉淀冷凍干燥后加水復(fù)溶，分別進(jìn)行β-葡聚糖及多糖含量的測定，每組處理3個(gè)平行，取各得率的平均值。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

采用超聲波-復(fù)合酶提取法，分別考察超聲功率（180W、240W、300W、360W、420W）、超聲時(shí)間（15m in、30min、45m in、60m in、75m in）、復(fù)合酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）、酶解時(shí)間（20m in、40m in、60m in、80m in、100m in）、酶解pH（4、5、6、7、8）對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率的影響，每組處理3個(gè)平行，取各得率的平均值。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解溫度為主要因素，以灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 菌絲體β-葡聚糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels o f orthogonalexperim ents for myce liumβ-glucan extraction process op tim ization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 9.0和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的比較

本試驗(yàn)采用4種方法對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖進(jìn)行提取，所得總多糖及β-葡聚糖得率結(jié)果如表2所示。

表2 不同提取方法的灰樹花菌絲體總多糖得率和β-葡聚糖得率Table 2 The yields of totalpolysaccharides andβ-glucan from G.frondosa m ycelium by different extraction m ethods

由表2可知，采用超聲波提取法所得的β-葡聚糖和多糖得率高于熱水浸提法，尤其是超聲波結(jié)合復(fù)合酶法得率提升幅度較大。超聲波可以有效地破碎菌絲體細(xì)胞壁，復(fù)合酶可以降解非多糖物質(zhì)，兩種方法有效結(jié)合從而利于多糖的釋放，使β-葡聚糖得率提高，而常規(guī)的熱水浸提法不僅提取時(shí)間較長而且提取效率低。綜上所述，超聲波-復(fù)合酶法為最佳的提取方法。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率對(duì)提取效果的影響

考察超聲功率對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲功率對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.1 Effectof ultrasonic power onβ-glucan yield

由圖1可知，當(dāng)超聲功率在180～240W范圍內(nèi)時(shí)，隨著超聲功率的增加，β-葡聚糖及總多糖得率均逐漸提高；當(dāng)超聲功率為240W時(shí)，β-葡聚糖得率達(dá)到最大值，為1.43mg/g；繼續(xù)增大超聲功率，β-葡聚糖得率有所下降，這可能由于超聲功率過大，物理剪切力變大使糖苷鍵斷裂，從而導(dǎo)致β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)被破壞，得率下降。因此，選擇超聲功率240W為宜。2.2.2超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

考察超聲時(shí)間對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.2 Effect of u ltrasonic time onβ-glucan yield

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的增加，β-葡聚糖及總多糖得率均呈先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為30min時(shí)，β-葡聚糖得率達(dá)到最大值，為1.07mg/g，得率先增加可能是因?yàn)榛覙浠ňz體細(xì)胞壁的破裂及β-葡聚糖的釋放需一定時(shí)間；而之后得率下降可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致局部溫度過高使β-葡聚糖降解，以及持續(xù)強(qiáng)度的空化效應(yīng)使得部分β-葡聚糖結(jié)構(gòu)破壞，使得率下降。因此，選擇超聲時(shí)間30m in為宜。

2.2.3 復(fù)合酶添加量對(duì)提取效果的影響

考察復(fù)合酶添加量對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.3 Effect of compound enzym e addition onβ-glucan yield

由圖3可知，當(dāng)復(fù)合酶添加量在0.5%～1.5%范圍內(nèi)時(shí)，β-葡聚糖及總多糖得率均隨復(fù)合酶添加量的增加而提高；當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.5%時(shí)，β-葡聚糖得率達(dá)到最大值，為1.55mg/g；繼續(xù)增大復(fù)合酶添加量，β-葡聚糖得率有所下降。可能是因?yàn)閯傞_始隨著復(fù)合酶添加量的增加，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，致使β-葡聚糖更快的分離出來，β-葡聚糖得率升高，但是當(dāng)復(fù)合酶添加量繼續(xù)增大到一定程度，一部分酶分子沒有機(jī)會(huì)與底物結(jié)合，底物被水解的速度降低，致使β-葡聚糖得率下降。因此，選擇復(fù)合酶添加量1.5%為宜。

2.2.4 酶解溫度對(duì)提取效果的影響

考察酶解溫度對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature onβ-glucan yield

由圖4可知，β-葡聚糖及總多糖得率總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。β-葡聚糖得率在酶解溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大值，為1.96mg/g。溫度是影響酶活的重要因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)，酶解速度會(huì)隨著溫度的升高而加快；隨著溫度的繼續(xù)升高，超過了最適的催化溫度，催化效率就會(huì)大大降低，因此，選擇酶解溫度40℃為宜。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響

考察酶解時(shí)間對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis tim e onβ-glucan yield

由圖5可知，當(dāng)酶解時(shí)間在20～100m in范圍內(nèi)時(shí)，β-葡聚糖及總多糖得率均隨酶解時(shí)間的延長而增加；繼續(xù)延長酶解時(shí)間，兩者得率趨于平穩(wěn)；酶解時(shí)間對(duì)β-葡聚糖及總多糖得率影響不大，當(dāng)酶解時(shí)間為80min時(shí)β-葡聚糖得率達(dá)到最大值，為2.42mg/g。因此，選擇酶解時(shí)間80min為宜。2.2.6酶解pH對(duì)提取效果的影響

考察酶解pH對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖及總多糖得率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解pH對(duì)β-葡聚糖得率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis pH onβ-glucan yie ld

由圖6可知，當(dāng)酶解pH值在4～6范圍內(nèi)時(shí)，β-葡聚糖及總多糖得率隨酶解pH的增大而提高，當(dāng)酶解pH值為6時(shí)，β-葡聚糖得率達(dá)到最大值，為1.71mg/g；繼續(xù)增大酶解pH，二者得率均開始下降，這可能是因?yàn)閜H的增大影響了酶和底物的親和力，酶的活性被破壞了，從而造成了β-葡聚糖得率的下降。因此，選擇酶解pH6為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)灰樹花菌絲體β-葡聚糖得率影響較大的關(guān)鍵因素，即超聲功率、超聲時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，確定灰樹花菌絲體β-葡聚糖的最佳提取工藝條件。按照L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表3所示，方差分析如表4所示。

表3 灰樹花菌絲體β-葡聚糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis oforthogonalexperim ents for G.frondosa m yceliumβ-glucan extraction process optim ization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperiments results

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知，各因素對(duì)β-葡聚糖得率影響的次序?yàn)槌晻r(shí)間（B）＞超聲功率（A）＞加酶量（C）＞酶解溫度（D）。由表4可知，超聲時(shí)間對(duì)β-葡聚糖得率有顯著影響（P＜0.05），其余因素對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），確定最優(yōu)水平組合為A3B1C2D2，即超聲功率為300W，超聲時(shí)間為15min，復(fù)合酶添加量為1.5%，酶解溫度為40℃，在此最佳提取條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得β-葡聚糖得率為2.80mg/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先比較了灰樹花菌絲體β-葡聚糖的4種提取方法，確定了超聲波-復(fù)合酶法為最佳提取方法，之后通過單因素與正交試驗(yàn)確定了超聲波-復(fù)合酶法提取的最佳工藝條件，即超聲功率300W，超聲時(shí)間15min，復(fù)合酶添加量1.5%，酶解溫度40℃，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，β-葡聚糖得率可達(dá)2.80mg/g。該方法操作簡便，不僅縮短了提取時(shí)間，而且提取效率也較高，為今后β-葡聚糖的規(guī)模化提取提供了理論依據(jù)。

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Optim ization ofextraction technology ofβ-glucan from Grifola frondosa mycelium

ZHONGM in1,WU Tianxiang1,2*,NIEWenqiang1,LU Hongyun1
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.M ingde College ofGuizhou University,Guiyang 550025,China)

Usingβ-glucan yield as the evaluation index,hotwater extraction,hotwater-compound enzyme extraction,ultrasonic extraction and ultrasonic-compound enzymeextractionmethod on the yield ofβ-glucan from myceliaof Grifola frondosa were investigated.Theultrasonic power,ultrasonic time,compound enzyme addition and enzymolysis temperature were determ ined as the key factors for influencing extraction.The extraction processwasoptim ized by orthogonalexperiments.The resultsshowed that theyield ofβ-glucan extracted by ultrasonic-compound enzyme extraction method was themaximum.The optimum extraction conditions ofβ-glucan from mycelia of G.frondosa were ultrasonic power 300W,ultrasonic time 15 min,compound enzyme addition 1.5%and enzymolysis temperature 40℃.Under the conditions,the yield ofβ-glucan from mycelia of G.frondosa was2.80mg/g.

Grifola frondosa;β-glucan;extraction;compound enzyme;orthogonalexperiment

Q538

0254-5071（2017）08-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.020

2017-04-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460537）

鐘敏（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：吳天祥（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程和生物轉(zhuǎn)化。