氣相色譜-質譜法測定酵素產品中短鏈脂肪酸

龐錦偉，姚欣，雷超，劉鋒軍

（1.渭南市產品質量監督檢驗所，陜西渭南714000；2.陜西省發酵產品質量監督檢驗中心，陜西渭南714000）

氣相色譜-質譜法測定酵素產品中短鏈脂肪酸

龐錦偉1，2，姚欣1，2，雷超1，2，劉鋒軍1，2

（1.渭南市產品質量監督檢驗所，陜西渭南714000；2.陜西省發酵產品質量監督檢驗中心，陜西渭南714000）

建立了用氣相色譜-質譜法（GC-MS）測定酵素樣品中5種短鏈脂肪酸（SCFA）的定性定量方法。結果表明，該方法可以有效分離測定酵素樣品中5種SCFA，該方法檢出限低（0.030～0.100mg/kg），加標回收率80.1%～110.6%，相對標準偏差（RSD）1.36%～10.0%。用該方法分析37種酵素樣品中SCFA，結果表明，86.5%的酵素產品檢出乙酸（1.02～36.1 g/kg），僅有一種酵素產品檢出丁酸（含量為0.056 g/kg），其余均未檢出。該方法適用于酵素產品中短鏈脂肪酸的檢測。

短鏈脂肪酸；酵素；氣相色譜-質譜法

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）通常是指碳鏈中碳原子數少于6個的有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等[1-3]。SCFA是由于飲食中不消化的淀粉、纖維多糖等在結腸腔內經厭氧菌（雙歧桿菌、乳桿菌、類桿菌等）酵解生成，其是結腸粘膜的主要能量供應來源，還可以維護腸道上皮細胞的完整性和杯狀細胞的分泌功能，同時還具有促進水、鈉吸收，刺激結腸上皮細胞增殖和黏膜生長，增加腸系膜血流和胃腸激素分泌等生理作用[4-8]。酵素是以動物、植物、菌類等為原料，經微生物發酵制得的含有特定活性成分的產品[9]，包括低聚糖、氨基酸、有機酸等營養成分以及具有生物活性的酶（蛋白酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等）、生物堿等功能性成分，能夠有效消除體內自由基，使酵素具有改善人體內微環境、提高免疫力、降低膽固醇等功效[10-19]。酵素流行于日本、中國臺灣等地區，近年來作為健康食品在我國逐步流行起來[20]。但由于缺乏相關技術標準和管理規范，導致目前市場魚龍混雜，部分生產者或銷售者在沒有檢驗數據的支持下宣稱其產品含有短鏈脂肪酸，造成消費者的困擾和執法難點，因此測定酵素產品中短鏈脂肪酸含量對制定產品方法標準、規范市場、加強監管等方面有著重要意義。

本研究建立了氣相色譜-質譜聯用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定酵素產品中乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸5種短鏈脂肪酸的定量分析方法，并對37種酵素產品樣品的分析。本方法具有簡單、快速、準確度高等特點，對酵素產品中短鏈脂肪酸的檢測和標準的制定奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸（色譜標樣）：天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜級）、其他試劑均為分析純：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

酵素樣品由某生產廠商直接提供，共計37個樣品。其中固體類酵素樣品24個，液體類酵素樣品13個；復合原料酵素樣品28個，單一原料酵素樣品9個。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、VF-WAXms毛細管色譜柱（30m×25mm×0.25μm）、DB-FFAP毛細管色譜柱（30m×25mm×0.25μm）、OV-351毛細管色譜柱（30m× 0.32mm×0.25μm）：美國Agilent公司；VG3S25漩渦振蕩器：德國IKA公司；AS20500A超聲波清洗器：天津奧特塞恩斯儀器有限公司；GL-20G-II低溫高速離心機：上海安亭科學儀器廠；0.22μm針頭式過濾器：天津津騰實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取1 g試樣（精確至0.01 g）置于50m L聚丙烯離心管中，加入5m L體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl），渦旋混勻1m in后500W超聲波提取15m in，待溶液冷卻后8 000 r/min離心5min（如固體類酵素則12 000 r/min離心8min，重復一次），取上清液通過0.22μm濾膜后上機[21]。

1.3.2 混合標準序列配制

分別稱取5種短鏈脂肪酸標準品（精確至0.1mg）于容量瓶中，加體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）定容至刻線，得到單短鏈脂肪酸標準儲備液，質量濃度分別為乙酸42.0mg/L，丙酸39.7mg/L，丁酸38.3mg/L，異戊酸37.6mg/L，戊酸37.0mg/L。分別移取1.00m L單短鏈脂肪酸標準儲備液至10m L容量瓶中，用體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2% HCl）稀釋至刻線，得到混合短鏈脂肪酸標準使用液。再用體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐級稀釋混合短鏈脂肪酸標準使用液成混合標準序列溶液。

1.3.3 氣質條件

程序升溫：初始溫度100℃，以5℃/min升至150℃后，升溫至240℃并保持3m in；進樣口溫度：230℃；輔助溫度：240℃；四極桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；進樣量：1μL；進樣方式：不分流進樣；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%）；載氣流速：2m L/m in。

1.3.4 定性定量分析

用所獲得的GC-MS圖譜與標準譜圖數據庫進行對比，將峰相似度＞90%的標本峰以及不同短鏈脂肪酸的分子離子峰作為選擇離子，根據軟件確定各離子的豐度和范圍。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇試驗

綜合考慮所測定的5種短鏈脂肪酸的沸點和極性并結合酵素樣品的特性，選擇VF-WAXms、DB-FFAP和OV-351三種色譜柱作為候選色譜柱進行分析測定，根據分離效果綜合考慮使用VF-WAXms毛細管色譜柱進行酵素產品中5種短鏈脂肪酸的分析測定[22]。

2.2 方法分離度和線性關系試驗

在所采用的儀器條件下，對5種短鏈脂肪酸的混合標液進行分析測定（見圖1），以考察5種SCFA的分離度和線性關系，結果見表1。

圖1 5種短鏈脂肪酸混合標液GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chrom atogram of five SCFAsm ixed standard solution analysis by GC-MS

表1 5種短鏈脂肪酸的出峰時間和線性關系結果Table 1 Results of peak time and linear relationships of five SCFAs

由圖1、表1可知，5種SCFA的出峰順序依次為：乙酸（3.65min）、丙酸（4.68m in）、丁酸（5.97m in）、異戊酸（6.62min）、戊酸（7.77m in），在所測定的濃度范圍內，5種SCFA均具有良好的分離度（分離度＞2）和線性關系（R2＞0.995），5種SCFA的線性范圍較寬，均可以達到102。

2.3 方法精密度和檢出限試驗

在所采用的儀器條件下，對混合標準序列溶液進行重復進樣（重復5次），以考察方法的穩定性，并用1∶1（V/V）甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐步稀釋混合標準序列溶液直至信噪比（S/N）＜3，以考察方法的檢出限，結果見表2。

表2 5種短鏈脂肪酸的穩定性和檢出限結果Table 2 Results of stability and lim its of detection of five SCFAs

由表2可知，在該儀器條件下，5種SCFA出峰時間偏差極小（0.001%～0.132%）、峰面積偏差和峰高偏差均在合理范圍內。根據試驗結果計算出該方法測定5種SCFA的檢出限為0.030～0.100mg/kg，表明該方法檢出限，完全能夠滿足檢測要求。

2.4 加標回收率試驗

向酵素樣品加入不同水平的混合標準溶液（加入量見表3），按照樣品處理方法處理后上機，每個濃度水平重復處理5次，以考察方法準確度，結果見表3。

表3 5種短鏈脂肪酸加標回收率試驗結果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests of five SCFAs

由表3可知，5種SCFA加標回收率為80.1%～110.6%，相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD）為1.36%～10.0%，表明該方法具有良好的準確度，方法可靠。

2.5 穩定性試驗

由于溶劑中含有甲醇，可能與標準品或樣品中酸類物質酯化反應影響測定結果，因此增加穩定性實驗，即在混合標準序列溶液配制后1～24 h使用所用方法分別進樣，以考察方法的穩定性。結果表明，隨著時間的推移，5中SCFA的標準峰面積呈現先穩定再逐步降低，10 h后出現相應短鏈脂肪酸酯的峰并逐漸增大，因此綜合考慮認為樣品處理完成后不易放置超過8 h，同時標準溶液也應現用現配，以免造成較大誤差。

2.6 酵素樣品中SCFA含量測定試驗

用上述方法對35種酵素樣品進行了5種SCFA含量測定。結果表明，乙酸是所檢酵素樣品中短鏈脂肪酸檢出率最高的，86.5%的酵素產品檢出乙酸成分，含量范圍為1.02～36.1 g/L，均值為7.8g/L。其中固體酵素檢出率（61.5%）遠低于液體酵素檢出率（100%），復合原料酵素檢出率（82.1%）遠低于單一原料酵素檢出率（100%）。剔除未檢出的樣品，固體酵素乙酸含量（12.21 g/L）遠高于液體酵素（6.39 g/L），復合原料酵素乙酸含量（9.13 g/L）約為單一原料酵素乙酸含量（4.55 g/L）的2倍。綜合而言，復合原料的固體酵素中乙酸含量多于其他酵素樣品。其他SCFA測定結果僅有一種酵素樣品檢出丁酸，含量為0.056 g/L，其余3種短鏈脂肪酸均未檢出。結合發酵工藝可以認為乙酸是酵素產品中最主要的短鏈脂肪酸。

3 結論

采用甲醇水溶液超聲提取酵素樣品中的短鏈脂肪酸，使用VF-WAXms毛細管色譜柱的GC-MS可以同時分離測定乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸5種SCFA，方法具有分離效果好，線性范圍0.037～4.200mg/L、回收率80.1%～110.6%，檢出限0.030～0.100mg/kg，穩定性好，操作簡便、準確度高等特點，將此方法應用于酵素實際樣品的測定，結果86.5%的酵素產品檢出乙酸成分（1.02～36.1 g/L），僅有一種酵素樣品檢出丁酸，其余3種短鏈脂肪酸均未檢出。該方法適用于酵素樣品中短鏈脂肪酸的檢測，也為酵素產品檢測的標準化奠定了理論和數據基礎。

[1]農業大詞典編輯委員會.農業大詞典[M].北京：中國農業出版社，1998：1948.

[2]王林云.養豬詞典[M].北京：中國農業出版社，2004：208.

[3]中國營養學會.營養科學詞典[M].北京：中國輕工業出版社，2013：357.

[4]RASMUSSEN H S,HOLTUG K,MORTENSEN P B.Degradation of amino acids to short-chain fatty acids in humans:An in vitro study[J]. Scand JGastroentero,1988,23(2):178-182.

[5]劉松珍，張雁，張名位，等.腸道短鏈脂肪酸產生機制及生理功能的研究進展[J].廣東農業科學，2013（11）：99-103.

[6]趙懷寶，任玉龍.短鏈脂肪酸在動物體內的生理特點和功能[J].飼料研究，2016（3）：29-32.

[7]TOPPINGD L,CLIFTONPM.Short-chain fatty acidsand human colonic function:Roles of resistant starch and nonstarch polysaccharides[J]. Physiol Rev,2001,81(3):1031-1064.

[8]TAN J,MCKENZIE C,POTAM ITISM,et al.The role of short-chain fatty acids in health and disease[J].Adv Imm unol,2014,121:91-119.

[9]中國生物發酵產業協會.T/CBFIA08001—2016酵素產品分類導則[S].北京：中國標準出版社，2016.

[10]郭爽.敖東酵素保健功能研究[D].長春：吉林大學，2015.

[11]劉加友.富含γ-氨基丁酸葛根酵素發酵及其解酒功能的研究[D].鎮江：江蘇大學，2016.

[12]馬巧靈.蘋果酵素對Ⅱ型糖尿病小鼠模型作用的實驗研究[D].大理：大理大學，2016.

[13]楊培青.藍莓果渣酵素制備工藝的研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2016.

[14]蔣增良.天然微生物酵素發酵機理、代謝過程及生物活性研究[D].杭州：浙江理工大學，2013.

[15]張靜雯.組合菌發酵過程中產生的微生物酵素及其生物活性研究[D].武漢：武漢輕工大學，2015.

[16]張思，王蕾，張志旭，等.16種市售酵素食品功能分析與評價[J].食品與機械，2016（9）：196-200.

[17]劉敏，熊燕，付忠旭，等.不同配方發酵的酵素產品中活性物質的對比研究[J].食品與發酵科技，2015，51（5）：27-31.

[18]李建強，溫立香，羅小杰，等.酵素三級發酵與自然發酵過程中SOD活性變化的研究[J].輕工科技，2016（1）：4-5.

[19]梁貴秋，吳婧婧，董桂清，等.食用桑椹酵素發酵工藝研究[J].食品與發酵科技，2016，52（6）：36-40.

[20]陳丹.淺論食用酵素[J].食品研究與開發，2016，37（12）：210-214.

[21]賈益群，葉福媛，王雙，等.生物樣品中短鏈脂肪酸的快速提取與分析方法[J].實驗室研究與探索，2012（7）：262-264.

[22]吳水蕓，強葉濤，程璐，等.氣相色譜-質譜聯用法檢測糞便中短鏈脂肪酸[J].臨床檢驗雜志，2015（4）：246-248.

Determ ination of short-chain fatty acids in fermentsby gaschromatography-massspectrometry

PANG Jinwei1,2,YAO Xin1,2,LEIChao1,2,LIU Fengjun1,2
(1.Weinan Supervision&Inspection Institute ofProductQuality,Weinan 714000,China; 2.ShaanxiProvincialSupervision and Inspection CenterforFermented ProductQuality,Weinan 714000,China)

The qualitative and quantitative analysismethods of 5 kindsof short-chain fatty acids(SCFA)in ferments sampleswere established by gas chromatography-massspectrometry(GC-MS).The resultsshowed that themethod could effectively separate the five kindsof SCFA in fermentssamples,and had low lim itsof detection(0.030-0.100mg/kg),adding standard recovery rate range 80.1%-110.6%,and relative standard deviation(RSD) 1.36%-10.0%.The determination resultsof37 kindsof fermentssamplesanalysisby themethod indicated thatacetic acid was detected in 86.5%fermentssamples(1.02-36.1 g/kg),butyric acid wasdetected in only one sample(0.056 g/kg),and other componentswere notdetected.Therefore,the method could be used fordetermination of five SCFAs in fermentsproducts.

short-chain fatty acids;ferment;gas chromatography-massspectrometry

O657.63

0254-5071（2017）08-0165-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.036

2017-05-26

龐錦偉（1990-），男，助理工程師，碩士，主要從事食品質量檢驗工作。