氣相色譜直接進樣法與頂空進樣法測定白酒中甲醇的比較

羅玥，成桂紅，鐘紅霞，王健，徐躍成

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都610100）

氣相色譜直接進樣法與頂空進樣法測定白酒中甲醇的比較

羅玥，成桂紅，鐘紅霞，王健，徐躍成

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都610100）

該實驗對氣相色譜直接進樣法與頂空進樣法測定白酒中甲醇的方法進行比較。直接進樣法測定按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的方法分析》進行，并對色譜條件進行了改進及優化；頂空進樣法測定時，對取樣量、加熱溫度進行優化，建立最佳色譜條件。兩種方法的線性范圍為0.032～1.288 g/L，線性相關系數R均＞0.999。直接進樣法的檢出限為0.04 g/L，加標回收率為90%～110%，相對標準偏差（RSD）＜1%，方法不確定度結果為（0.166±0.012）g/L；頂空進樣法的檢出限為0.02 g/L，加標回收率范圍為90%～110%，相對標準偏差（RSD）＜3%，方法不確定度結果為（0.160±0.012）g/L。以兩種方法測定市售20種白酒樣品，測定結果經配對t檢驗，無顯著性差異（P＞0.05）。直接進樣法無前處理過程，簡單快速精密度高；頂空進樣法檢出限更低，靈敏度更高。

氣相色譜直接進樣；頂空進樣；甲醇；白酒

甲醇是一種無色透明、易揮發性液體，在人體內代謝產物為甲醛、甲酸，有很強的毒性，尤其對視神經損害嚴重，誤飲過量的甲醇會引起失明或中毒死亡[1-5]。白酒是以糧谷、薯類、水果、乳類等為主要原料，經發酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒，白酒中少量的甲醇可構成白酒不同的風格，過量則有害健康。目前，甲醇的檢測方法有比色法、滴定法、生物傳感器法、液相色譜法、氣相色譜法，氣相色譜法是世界上公認的測定酒中甲醇的方法[6]。GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的方法分析》中甲醇的測定方法有比色法和氣相色譜直接進樣法[7]，比色法操作繁瑣、費時[8]，氣相色譜法采用填充柱恒溫進樣，對成分復雜的白酒分離效果差[9]。本實驗擬選用毛細色譜柱對氣相色譜直接進樣法和頂空進樣法分別進行色譜條件優化，用最佳色譜條件分別進行方法學驗證，目的是便于選擇白酒中甲醇含量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇（色譜純）：天津四友精細化學品有限公司；甲醇色譜標樣（純度為99.5%）：天津市化學試劑研究所；超純水（電導率為18.2MΩ）：M illi-Q超純水機制備；20種白酒（編號為1#～20#）：市售。

取色譜純乙醇用超純水配制成體積分數60%的乙醇溶液，用作溶劑及試劑空白；標準儲備液的配制：取1m L甲醇色譜標樣稱質量為0.805 0 g，用體積分數60%乙醇溶液定容至50m L，得16.1 g/L甲醇標準儲備液，備用。標準使用液的配制：分別準確吸取標準儲備液0.02m L、0.05m L、0.10m L、0.20m L、0.40m L、0.80m L于10m L容量瓶中，用體積分數60%乙醇溶液定容至10m L，現用現配。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀（gas chromatography，GC）配氫火焰檢測器（flame ionization detector，FID）及OpenLAB工作站、7697A頂空（Headspace，HS）自動進樣器、HP-INNOWAX毛細色譜柱（30m×0.32mm×0.50μm）、HP-INNOWAX毛細色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）、CP-WAX57CB色譜柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美國安捷倫科技有限公司；2010plus氣相色譜儀配氫火焰檢測器（flame ionization detector，FID）及GCsolution工作站：日本島津公司；M illi-Q超純水機：密理博中國有限公司；XS105電子天平：瑞士METTLERTOLEDO集團；吉爾森移液器（100～5000μL）：法國GILSON公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

（1）直接進樣法

AgilentCP-wax57CB色譜柱；程序升溫：30℃保持8m in，以2℃/m in升至70℃，保持1min，再以50℃/min升至190℃，保持4m in；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：280℃；分流比：50∶1；柱流速：0.80m L/min；定量方法：外標法；進樣體積：0.5μL。

（2）頂空進樣法

AgilentHP-INNOWAX色譜柱；程序升溫：40℃保持8m in，以5℃/m in升至100℃，不保持，再以40℃/m in升至180℃，保持4min；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；定量方法：外標法；進樣體積：1m L；頂空自動進樣器條件：加熱箱90℃，定量環100℃，傳輸線110℃，樣品瓶平衡時間20m in，進樣持續時間：0.5min，進樣循環36min。

1.3.2 測定步驟

直接進樣法取混勻的標準使用液及酒樣約1m L于進樣小瓶，待測；頂空進樣法準確取混勻的標準使用液及酒樣各2m L于20m L頂空瓶中，壓緊瓶蓋，待測。待儀器工作正常且穩定后，依次對標準使用液各濃度梯度、空白、加標回收、樣液進行測定。

2 結果與分析

2.1 直接進樣法色譜條件優化

甲醇沸點為64.7℃[10]，選擇氣化溫度80℃、90℃、100℃、120℃、150℃、200℃、220℃，程序升溫條件：40℃保持5m in，以5℃/min速率升至200℃，保持1min，檢測器：280℃，分流比：40∶1，進樣體積：0.5μL，在此條件下對甲醇標品定性并比較峰面積，結果表明，氣化溫度不低于150℃時，甲醇峰峰面積趨于穩定且峰形好，因此選擇150℃作為進樣口溫度。但是對于成分比較復雜的白酒樣品時會發現甲醇峰和其他峰包裹的現象，繼續做了如下優化：選擇進樣口溫度220℃，檢測器280℃條件不變情況下，分別對初始柱溫保持時間、初始柱溫、初始柱溫保持時間、柱流速、程序升溫速率、分流比、進樣量進行一系列優化試驗[11-13]，確定直接進樣法測白酒中甲醇的色譜條件為：進樣體積0.5μL，進樣口溫度220℃，柱流速0.8m L/m in，分流比50∶1，程序升溫30℃保持8m in，以2℃/min升至70℃，保持1m in，再以50℃/m in升至190℃，保持4m in。此條件下甲醇峰峰形好，白酒樣品中甲醇峰的分離度為1.268，直接進樣法甲醇標準溶液色譜圖及白酒樣品色譜圖見圖1。

圖1 直接進樣法甲醇標準溶液（A）及白酒樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by direct injection

2.2 頂空進樣法色譜條件優化

2.2.1 HP-INNOWAX毛細色譜柱優化

HP-INNOWAX色譜柱的最低使用溫度為40℃，初始溫度40℃不變的情況下，對初始溫度保持時間、柱流速、程序升溫速率、分流比、進樣量參照直接進樣法進行優化，甲醇峰不能得到理想的優化條件，于是考慮換用HP-INNOWAX色譜柱，在上述優化條件下繼續優化，得到頂空進樣的最佳色譜條件：程序升溫為40℃保持8min，以5℃/min升至100℃，不保持，再以40℃/min升至180℃，保持4min；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；頂空自動進樣器條件：加熱箱90℃，定量環100℃，傳輸線110℃，樣品瓶平衡時間20m in，進樣持續時間0.5m in，進樣循環36m in。

2.2.2 樣品瓶加熱溫度及取樣量優化

因為甲醇沸點為64.7℃，樣品瓶加熱溫度分別設為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃進行試驗，60℃、70℃響應值較小，100℃有拖尾峰，因此確定90℃為最佳樣品瓶加熱溫度。樣品瓶中分別取1m L、2m L、3m L、4m L、5m L進行試驗。結果表明，進樣量不低于2m L時甲醇峰峰面積幾乎無變化，確定標準溶液及樣品取樣量為2m L。在此優化條件下，測得白酒樣品中甲醇峰分離度為2.82，頂空進樣法甲醇標準溶液色譜圖及白酒樣品色譜圖見圖2。

圖2 頂空進樣法甲醇標準溶液（A）及白酒樣品（B）色譜圖Fig.2 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by headspace injection method

2.3 線性范圍、相關系數及檢出限的比較

分別用兩種方法測定配制的甲醇標準使用液系列濃度，兩種方法的標準曲線線性范圍、相關系數及檢出限結果見表1。

表1 直接進樣法與頂空進樣法的線性范圍、相關系數及檢出限Table 1 Linear range,correlation coefficient and detection lim it of direct injection m ethod and headspace injection method

由表1可知，兩種方法得到線性范圍0.0322～1.288g/L，以甲醇含量（X，g/L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標的甲醇標準曲線回歸方程相關系數R均0.999。表明兩種方法均有良好的線性關系，優化后的直接進樣法檢出限（0.04g/L）高于頂空進樣法檢出限（0.02 g/L）。

2.4 精密度實驗

取16.1 g/L甲醇標準儲備液0.25m L用陰性樣品定容至25m L，混勻后分別用兩種方法進行精密度考察（平行實驗6次），結果見表2。

表2 直接進樣法與頂空進樣法的精密度比較Tab le 2 Com parison of precision of direct in jection m ethod and headspace injection method

由表2可知，直接進樣法相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD）＜1%，頂空進樣法RSD＜3%，頂空進樣法更接近真值，精密度符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的技術要求[14]。

2.5 回收率實驗

選擇加標質量濃度0.048 g/L、0.161 g/L、0.483 g/L三個不同質量濃度水平對3個不同酒樣進行加標實驗，考察兩種方法的準確度，結果見表3。

表3 兩種方法加標回收率結果Tab le 3 Adding standard recovery results of two methods

由表3可知，兩種方法的加標回收率為90%～110%，表明兩種方法準確度較好。

2.6 樣品測定

取20種市售白酒分別用兩種方法進行測定，結果見表4。

表4 兩種方法測定20種白酒中甲醇結果比較Table 4 Comparison of the results of the methanol content determ ination by two m ethods

由表4可知，兩種方法測定結果經配對t檢驗，t=1.068，兩種方法測定白酒中甲醇無顯著性差異[15]（P＞0.05）。

2.7 不確定度比較

按標準曲線外標法計算白酒試樣中甲醇含量，計算公式如下：

式中：X為白酒中甲醇含量，按100%酒精度折算，g/L；C為由標準曲線計算出進樣液中甲醇含量，g/L；B為實測酒精度，%vol；100為按100%酒精度換算[16]。

通過計算公式建立數學模型，不確定度評定步驟如下：①根據6次平行測定結果計算A類相對標準不確定度②B類不確定度由甲醇色譜標樣、實測酒精度、儀器引入相對標準不確定度[17-19]。通過合成計算得到不確定度結果見表5。

表5 兩種方法的不確定度結果Table 5 Uncertainty rep resentation results o f two m ethods

由表5可知，直接進樣法的方法不確定度結果為（0.166±0.012）g/L；頂空進樣法的方法不確定度結果為（0.160±0.012）g/L。

2.8 再現性實驗

實驗室內不同時間不同人員進行再現性實驗，選擇0.03 g/L、0.09 g/L兩個質量濃度進行6次加標實驗，結果見表6。

表6 再現性實驗結果Table 6 Results of reproducibility experiments

由表6可知，精密度和回收率范圍均能滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》中的技術要求，說明兩種方法再現性好。

3 結論

本實驗通過氣相色譜直接進樣法和頂空進樣法分別從條件優化到方法學驗證比較，結果表明，兩種方法各項指標都能滿足實驗室要求。兩種方法的線性范圍為0.032 2～1.288 0 g/L，線性相關系數R均＞0.999。直接進樣法的檢出限為0.04 g/L，加標回收率為90%～110%，相對標準偏差（RSD）＜1%，方法不確定度結果為（0.166±0.012）g/L；頂空進樣法的檢出限為0.02 g/L，加標回收率范圍為90%～110%，相對標準偏差（RSD）＜3%，方法不確定度結果為（0.160±0.012）g/L。以兩種方法測定市售20種白酒樣品，測定結果經配對t檢驗，無顯著性差異（P＞0.05）。直接進樣法無前處理過程，簡單快速精密度高；頂空進樣法檢出限更低，靈敏度更高。兩種方法各有優點，可靈活運用于白酒中甲醇含量的測定。

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Comparison of direct injection and headspace injectionmethod in determ ination ofmethanol in Baijiu

LUO Yue,CHENGGuihong,ZHONG Hongxia,WANG Jian,XU Yuecheng
(Sichuan Institute ofProductQuality Supervision&Inspection,Chengdu 610100,China)

Themethanol determinationmethod in Baijiu was compared between the direct injectionmethod and headspace injectionmethod.The direct injectionmethod was conducted according to GB/T 5009.48—2003 by directsampling,and the chromatographic conditionswere improved and optimized.When thesamplesweremeasured bymethanolheadspacemethod,the sample volume,heating temperaturewasoptim ized and theoptimal chromatographic condition wasestablished.The linearity of twomethods ranged from 0.032 g/L to 1.288 g/L.The detection lim itof direct injection method was0.04 g/L,the adding standard recovery rate rangewas90%-110%,relative standard deviation(RSD)＜1%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.166±0.012)g/L.The detection limitof headspacemethod was0.02 g/L,theadding standard recovery rate rangewas90%-110%, RSD＜3%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.160±0.012)g/L.Twomethodswere used to determine the 20 kindsof Baijiu samples,the resultswere analyzed by paired t test,and therewasno significantdifference(P＞0.05).The direct injectionmethod had no pretreatmentprocess,it wassimple and rapid w ith high precision,low sensitivity.The detection lim itofheadspacemethod was lower,and the sensitivitywashigher.

gas chromatography directinjection;headspace injection;methanol;Baijiu

O657.7

0254-5071（2017）08-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.035

2017-02-27

羅玥（1986-），女，工程師，本科，主要從事食品檢驗方面的工作