藥桑葉多糖提取工藝優化及其降血糖活性研究

韓愛芝，王麗君，賈清華，王子坤，馬玲，楊玲*

（1.塔里木大學分析測試中心，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，生命科學學院，塔里木大學，新疆阿拉爾843300）

藥桑葉多糖提取工藝優化及其降血糖活性研究

韓愛芝1，2，王麗君1，賈清華1，王子坤1，馬玲1，楊玲1，2*

（1.塔里木大學分析測試中心，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，生命科學學院，塔里木大學，新疆阿拉爾843300）

采用Box-Behnken試驗設計對藥桑葉多糖提取條件（液料比、提取溫度、提取時間）進行優化，并用對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）法對藥桑葉多糖進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。結果顯示，藥桑葉粗多糖提取最佳工藝為：在液料比25∶1（m L∶g），提取溫度90℃、提取時間3 h條件下，藥桑葉粗多糖提取率最高為（13.39±0.53）%。降血糖初步研究結果為：藥桑葉粗多糖對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制活性，其半抑制濃度（IC50）為0.96mg/m L。

藥桑葉；Box-Behnken試驗；多糖；降血糖活性

藥桑葉為桑科（Moraceae）桑屬（Morus Linn.）黑桑種的一種樹葉，我國國家衛生部于1993年公布桑葉為藥食兩用品。2010年版的《中華人民共和國藥典》中記載桑葉性甘、苦、寒，歸肺經和肝經[1]。《本草綱目》中記載桑葉不僅可以清肝明目，而且能去除水腫與腳氣；可代茶止渴；且煎煮飲用后，還有利于五臟六腑[2]。現代大量藥理學研究證明，桑葉具有降低血糖、血壓、血脂，抗氧化、保肝、抑制體內有害過氧化物生成與有害細菌繁殖等生理活性[3-6]。桑葉多種生理活性與其活性成分密切相關，根據文獻報道，藥桑葉含有豐富的多糖、生物堿、黃酮、多酚類和微量元素等活性成分[7-8]。

近年來，糖尿病患者急劇上升，抗糖尿病藥物的研究成為當前新藥研發的重點領域。眾多醫學研究發現，人體內存在諸多活性生物酶（如α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶等），血糖水平要通過這些酶進行調節。α-葡萄糖苷酶的活性就是由其抑制劑通過競爭性抑制而阻斷雙糖溶液水解成單糖溶液，從而延緩單糖的吸收，進一步達到治療糖尿病的效果，所以抑制α-葡萄糖苷酶活性成為控制血糖水平的關鍵。因此提取制備抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質具有十分重要的現實意義，李潔等[9]提取的雪菊多糖和季濤等[10]制備的桑葉多糖在體外顯示出對α-葡萄糖苷酶的較好抑制作用。

目前，對藥桑葉的研究多集中在生物堿[11]和黃酮類[12]的研究，對藥桑葉多糖及其降血糖活性研究相對較少。本實驗采用響應面法（response surfacemethodology，RSM）的Box-Behnken試驗設計對藥桑葉粗多糖的提取工藝進行優化，用對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，p-NPG）的方法測定藥桑葉粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，從而初步評估藥桑葉粗多糖的降血糖活性，結果可為選取藥桑葉資源及其降血糖活性研究奠定理論與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

藥桑葉于2016年7月采于新疆庫車、和田，經塔里木大學植科院李志軍教授鑒定為藥桑（Morusnigra L.）葉。將采摘的藥桑葉自然陰干后，粉碎過60目篩，備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）、α-葡萄糖苷酶（酶活力107 U/m L）：美國Sigma公司；濃硫酸、苯酚、無水乙醇（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；阿卡波糖片：拜耳醫藥保健有限公司。

1.2 儀器與設備

Varian cary 100型紫外-可見光分光光度計：美國瓦利安公司；AE240S型電子分析天平：德國梅特勒-托利多公司；TDL-5-A低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；InfiniteM 200 PRO多功能酶標儀：瑞士帝肯（Tecan）公司。HPX-9272MBE恒溫箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工藝流程

過60目篩的藥桑葉粉→熱水浸漬提取（溫度90℃、提取時間3 h、液料比25∶1（g∶m L））→離心（5 000 r/m in，5min）取上清液定容→計算多糖提取率→濃縮提取液→體積分數為80%乙醇沉淀→離心（5 000 r/min、5m in）取沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→冷凍干燥→藥桑葉粗多糖。

1.3.2 多糖含量測定

多糖含量的測定采用硫酸-苯酚法[13]。于波長490 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，得標準曲線方程A=0.0158C+0.0067（R2= 0.998），在范圍0～50.4μg/m L內線性關系良好。

藥桑葉多糖的測定：準確量取2m L藥桑葉多糖提取溶液，按照標準曲線操作步驟測定吸光度值后計算多糖質量濃度，藥桑葉粗多糖提取率按照下式計算：

式中：C為多糖質量濃度，μg/m L；V為樣品溶液體積，m L；D為樣品稀釋倍數；m為樣品總質量，g。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取藥桑葉粉末各5 g，浸提溶劑為蒸餾水，依次按照液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（m L∶g））、提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、提取次數（1、2、3、4、5次）進行提取。每組3個平行試驗，以藥桑葉多糖提取率為評價指標，考察液料比、提取溫度、提取時間和提取次數對藥桑葉多糖提取率的影響。

1.3.4 響應面法對工藝進行優化

以單因素試驗結果為基礎，取影響比較顯著的液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，以多糖提取率（Y）為響應值，根據DesignExpertV8.06軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計優化試驗工藝，所取因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 藥桑葉粗多糖的α-糖苷酶抑制活性測定

多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的測定參照趙堂彥等的方法[14]，略加改進，采用96微孔板篩選法，首先加入磷酸緩沖液（pH=6.8）80μL，加入16μL不同質量濃度的樣液，再加入0.2 U/m L的α-葡萄糖苷酶溶液16μL，置于37℃恒溫箱內恒溫15min，然后再加入2.5mmol/L的p-NPG 16μL，在37℃恒溫30min，分別加入1.0mol/LNa2CO3溶液100μL，在波長405 nm條件下采用酶標儀測定吸光度值A1，測定樣品本底吸光度值A2，并用不加樣品測定酶的活力吸光度值A0。用同種方法以阿卡波糖作為陽性對照，α-葡萄糖苷酶清除率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對多糖提取率的影響

圖1 液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-so lid ratio on polysaccharides extraction rate

由圖1可知，隨著液料比在10∶1～30∶1（m L∶g）范圍內增大，藥桑葉多糖提取率呈上升趨勢，在液料比15∶1～25∶1（m L∶g）時多糖提取率迅速上升，從7.70%上升至12.29%。但是在25∶1～30∶1（m L∶g）范圍內，多糖提取率上升緩慢，僅增加了0.85%。綜合考慮，選取液料比為25∶1（m L∶g）。

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2可知，提取溫度從60～90℃范圍內藥桑葉多糖提取率迅速上升，從7.33%上升至13.70%；當提取溫度從90～100℃時，多糖提取率幾乎不變，僅提高0.03%，因此確定90℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction tem perature on polysaccharides extraction rate

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響

圖3 提取時間對粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect o f extraction time on polysaccharides extraction rate

由圖3可知，提取時間為1 h時，多糖提取率較低，為6.93%；當提取時間在1～3 h時，多糖提取率大幅度的提高，增加了4.41%。提取時間從3～5 h時，多糖提取率上升緩慢，為了提高效率，綜合考慮選最佳提取時間為3 h。

2.1.4 提取次數對多糖提取率的影響

圖4 提取次數對粗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction tim es on polysaccharides extraction rate

由圖4可知，提取次數從1次到2次，藥桑葉多糖提取率迅速上升，多糖提取率增加了4.63%；隨著提取次數的增加，多糖提取率上升緩慢，從2次到5次，只提高1.48%，綜合成本及效率，確定2次為最佳提取次數。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計結果

在單因素試驗基礎上，以對提取率影響顯著的液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，以多糖提取率（Y）為響應值進行評價，采用3因素3水平響應面分析試驗，試驗方案及結果見表2，通過Box-Behnken中心組合對試驗數據進行二次響應面回歸分析，得到的藥桑葉多糖提取率與各自變量的模擬方程為：

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 響應面試驗方差分析

回歸方程各因素方差分析結果見表3。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression mode l

由表3可知，該模型P＜0.01，說明該二次方程模型為極顯著，該模型具有統計數意義。決定系數R2=0.996 1，表明該回歸模型擬合度較好，回歸方程具有代表性，有99.61%響應值變化來自于所選的變量；由模型調整系數為R2adj= 0.9912，表明此模型的預測性較好，所得實驗值與預測值較為接近。方程的失擬項P=0.501 7＞0.05，為不顯著，說明此方程對試驗擬合程度好、誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果分析和預測[15]，因此該方程模型適合藥桑葉多糖提取工藝參數的優化。

表3結果顯示，F值的大小可以判斷各因素對多糖提取率影響的強弱。F值越大對提取率影響作用越強。對藥桑葉多糖提取率的影響程度大小的各因素次序為：提取溫度（B）＞液料比（A）＞提取時間（C）。其中一次項提取溫度（B）對多糖提取率的影響為差異顯著影響因素（P＜0.05）；交互項AB、AC、BC，二次項A2、B2、C2對多糖提取率的影響極顯著（P＜0.01）。2.2.3響應面模型充分性診斷

由圖5可知，試驗值和預測值結果較為一致，說明此藥桑葉多糖提取回歸模型擬合度較好。由殘差分析結果可知，所得實驗數據沒有異常出現，均落在置信區間內。殘差的正態概率分布圖上所有的數據點基本都接近一條直線，且方差不具有偏差性。說明此試驗響應值的殘差概率分布符合正態分布。

圖5 模型充分性的診斷Fig.5 Diagnostic plots for the mode ladequacy

2.2.4 響應面分析結果

將模型中的某一因素固定在零水平而獲得另外兩個因素的交互作用，其等高線圖及響應曲面的形狀可以反映交互效應的強弱，結果見圖6。由圖6可知，在試驗范圍內，藥桑葉多糖提取率隨液料比和提取溫度的升高而逐漸增大，各因素間表現出顯著的交互作用關系。隨著溫度的升高多糖分子內能逐漸增大，分子運動增強，從而使溶解性變大；但是溫度過高會破壞多糖分子結構，可能使雜質溶入更多，以造成最后樣品中多糖提取率偏低。所以應將溫度應控制在一個適宜的范圍內。在一定范圍內，隨著液料比增大，多糖提取率逐漸大，液料比達到一定值后，溶劑基本將多糖全部溶出，液料比再增加多糖提取率變化不大。從節約溶劑的角度考慮液料比應選擇一個較合適的范圍。隨著提取時間的延長，有利于藥桑葉多糖溶出而使提取率逐漸變大，但提取時間過長，反而影響生產效率，所以提取時間也要選擇在一個較合適的范圍。

圖6 液料比、提取溫度及提取時間交互作用對多糖提取率影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of e ffects o f interaction between liquid-solid ratio,extraction tem perature and extraction tim e on polysacchrides extraction rate

根據Box-Behnken中心組合試驗設計對多糖提取工藝條件進行優化，在模型取值范圍內選擇起始點作為最低點，將高值選擇一個極大值，采用模型快速上升法進行優化，得最優工藝條件為液料比25.06∶1（m L∶g）、提取溫度90.55℃、提取時間2.98 h。在此條件下藥桑葉多糖提取率理論值為13.54%。為了驗證真實值與優化結果的一致性，將上述優化結果進行驗證試驗，為便利試驗操作，將優化結果修正為液料比25∶1（m L∶g）、提取溫度90℃、提取時間3 h。在此條件下做5組驗證試驗，結果藥桑葉多糖提取率實際平均值為（13.39±0.53）%，與預測值接近，且重復性好，說明優化結果可靠。

2.3 α-糖苷酶抑制活性的測定

經硫酸-苯酚法測定，醇沉后藥桑葉多糖含量為48.85%（后文中的藥桑葉多糖均指醇沉后用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后的藥桑葉多糖）。將藥桑葉多糖用于α-葡萄糖苷酶活性的檢測，以阿卡波糖為陽性對照，結果如圖7所示。由圖7可知，隨著藥桑葉多糖質量濃度的增加，抑制率也在增加，在藥桑葉多糖質量濃度范圍0.25～2.00mg/m L內對α-葡萄糖苷酶的抑制活力表現出強烈的質量濃度依賴性，其質量濃度與抑制率呈一定的線性相關，其回歸方程為y=30.572x+ 13.546（R2=0.938 3），得其相應半抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）值為0.96mg/m L，當多糖質量濃度＞2.00mg/m L時進入平臺期，抑制活力隨抑制劑質量濃度增大變化不大。這表明藥桑葉多糖具有抑制糖吸收的功能，這與趙駿等[16]的研究結果相一致。而藥桑葉多糖降糖效果明顯稍弱于陽性對照阿卡波糖，且與阿卡波糖呈現幾乎平行的抑制曲線。總體上藥桑葉多糖具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖7 α-葡萄糖苷酶抑制率隨多糖質量濃度變化的關系Fig.7 Relationship ofα-glycosidase inhibitory activity and po lysacchrides concentration

3 結論

采用Box-Behnken中心組合試驗設計進行藥桑葉多糖提取工藝優化方法可靠。優化的工藝參數結果為：液料比25∶1（m L∶g）、提取溫度90℃、提取時間3 h。此條件下的藥桑葉多糖提取率為（13.39±0.53）%，驗證試驗結果表明優化工藝條件可靠。

醇沉洗滌后的藥桑葉多糖含量升至48.85%。以此藥桑葉多糖進行α-葡萄糖苷酶抑制劑活性檢測，結果表明，在藥桑葉多糖質量濃度為0.25～2.00mg/m L范圍內，其半抑制濃度（IC50）為0.96mg/m L，說明藥桑葉粗多糖有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，為開發利用藥桑葉提供了一定的理論依據。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：279-280.

[2]李時珍.本草綱目[M].北京：人民衛生出版社，1976：174.

[3]ELMAWLA A M A A,KHALED M M,ASHRAFM M,etal.Induction of biologically active flavonoids in cell cultures of Morus nigra and testing theirhypoglycem ic efficacy[J].Sci Pharm,2011,79(4):951-961.

[4]HEND M T.Hepatoprotective effect ofmulberry(Morus nigra)leaves extractagainstmethotrexate induced hepatotoxicity inmalealbino rat[J]. BMC Complem ent Altern M ed,2015,15(1):252-253.

[5]MUHAMMAD IQ,MUHAMMAD A,ZUBAIR I.Anticancer activity of Morusnigra leavesextract[J].Bangladesh JPharmacol,2014,9(4):496-497.

[6]KUMARSA,SHARMARK,SHARMA V,etal.Isolation,morphological identification and in vitro antibacterial activity of endophytic bacteria isolated from Morusnigra(Mulberry)leaves[J].J Anim Res,2017,7(1): 155-164.

[7]陰新負，彭效明，李翠清，等.桑葉生物堿和多糖的分離純化研究進展[J].中醫藥導報，2016，22（14）：108-110，113.

[8]王賀，韓愛芝，賈清華，等.新疆藥桑和黑桑營養成分及活性成分分析[J].食品科學，2016，37（8）：91-96.

[9]李潔，曾紅，呂喜鳳，等.昆侖雪菊多糖抗氧化及對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制[J].中國釀造，2014，33（9）：124-128.

[10]季濤，宿樹蘭，郭盛，等.基于α-葡萄糖苷酶抑制活性評價桑葉多組分藥效相互作用研究[J].中國中藥雜志，2016，41（11）：1999-2006.

[11]孫蓮，朱衛敏，何悅，等.新疆藥桑葉中1-脫氧野尻霉素定性及定量分析[J].中國現代中藥，2016，18（10）：1291-1295.

[12]TALLINIA LR,GRAZIELEPR P,BORDIGNONB SA L,etal.Analysisof flavonoidsin Rubuserythrocladus and M orusnigra leavesextracts by liquid chromatography and capillary electrophoresis[J].Rev Bras Farm acogn,2015,25(3):219-227.

[13]吳龍月，陳瑤，向福，等.杏鮑菇多糖的酶法提取及其保濕和抗氧化活性評價[J].中國釀造，2017，36（5）：161-165.

[14]趙堂彥，孟茜，王琴，等.鷹嘴豆水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[J].食品研究與開發，2016，37（5）：4-7.

[15]SHANNON E,ABUGHANNAM N.Optimisation of fucoxanthin extraction from Irish seaweedsby responsesurfacemethodology[J].JAppl Phycol,2017,29(2):1027-1036.

[16]趙駿，方玲，于坤路，等.桑葉多糖不同分子量段降血糖作用研究[J].中藥材，2010，33（1）：108-110.

Optim ization of polysaccharidesextraction technology from Morusnigra leavesand itshypoglycem ic activity

HAN Aizhi1,2,WANG Lijun1,JIA Qinghua1,WANG Zikun1,MA Ling1,YANG Ling1,2*
(1.Analytic Center,Tarim University,Alar843300,China;2.Key Laboratory ofProtection&Utilization ofBiologicalResources in Tarim Basin ofXinjiang Production and Construction Corps,College ofLife Sciences,Tarim University,A lar843300,China)

Extraction parameters of polysaccharides from Morus nigra leaves,such as liquid-solid ratio,extraction temperature and time,was optimized with Box-Behnken experiments.The inhibition rate of polysaccharides from M.nigra leaves againstα-glycosidasewasmeasured by p-NPG method.The resultsshowed thatthepolysaccharidesextraction rateof M.nigra leaveswas thehighestof(13.39±0.53)%under theoptimized conditions of extraction temperature 90℃,time 3 h and liquid-solid ratio 25∶1(m l∶g).The preliminary resultsof hypoglycem ic activity showed that the crude polysaccharides from M.nigra leaves had good hypoglycemic inhibition activity againstα-glycosidase,and halfmaximal inhibitory concentration (IC50)was0.96mg/m l.

Morusnigra leaves;Box-Behnken experiment;polysaccharides;hypoglycemic activity

Q946.3

0254-5071（2017）08-0139-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.030

2017-06-12

國家自然科學基金（N0.31460080）；塔里木大學校長基金（TDZKQN201513）

韓愛芝（1973-），女，實驗師，碩士，研究方向為天然產物分子結構及功能。

*通訊作者：楊玲（1965-），女，教授，碩士，研究方向為天然產物分子結構及功能。