產己酸菌LysinibacillusfusiformisSigA基因的克隆、表達及生物信息學分析

薛正楷，薛原，楊根慶，張宿義，倪斌，6

（1.瀘州職業技術學院白酒學院，四川瀘州646001；2.瀘州市生物醫學工程研究所，四川瀘州646000；3.同濟大學化學科學與工程學院，上海200016；4.新鄉醫學院第三附屬醫院檢驗科，河南新鄉453003；5.瀘州老窖股份有限責任公司，四川瀘州646000；6.瀘州江潭窖酒業有限公司，四川瀘州646300）

產己酸菌LysinibacillusfusiformisSigA基因的克隆、表達及生物信息學分析

薛正楷1，2，薛原3，楊根慶4，張宿義5，倪斌5，6

（1.瀘州職業技術學院白酒學院，四川瀘州646001；2.瀘州市生物醫學工程研究所，四川瀘州646000；3.同濟大學化學科學與工程學院，上海200016；4.新鄉醫學院第三附屬醫院檢驗科，河南新鄉453003；5.瀘州老窖股份有限責任公司，四川瀘州646000；6.瀘州江潭窖酒業有限公司，四川瀘州646300）

通過克隆產己酸菌LysinibacillusfusiformisSigA全長基因，并對其進行表達和生物信息學分析。結果表明，SigA基因開放閱讀框（ORF）有1 128個堿基，編碼327個氨基酸，其分子質量為45.275 kDa；生物信息學預測表明，L.fusiformis與Lysinibacillussphaericus具有較近的親緣關系，二者序列相似度達97%；該蛋白為親水性可溶性蛋白，與Bacillus sp.B14905相似度達100%，其二級結構主要由α-螺旋和loop環狀構成，α-螺旋和loop環狀分別占其二級結構的60.15%和37.79%；預測并優化的三級結構由14個α-螺旋和15個loop構成。

產己酸菌；Lysinibacillusfusiformis；SigA基因；生物信息學

細菌的轉錄是一個復雜的過程，由多種分子共同調控，其中核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶是催化轉錄合成RNA的重要酶，也是調控基因轉錄的關鍵酶，是以脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或RNA為模板合成RNA的酶，全酶是由核心酶及一個獨立的亞基σ因子兩部分組成。σ因子參與了轉錄起始的各個過程，包括啟動子的定位、啟動子的解鏈、起始RNA的合成、脫離啟動子等過程[1-3]。σ因子種類繁多，目前在美國國家生物技術信息中心（nationalcenterofbiotechnology information，NCBI）數據庫中，細菌σ因子基因序列已高達31 236條。σ因子按其功能，可分為σ70和σ54家族，σ70屬于細菌σ因子的一個家族，它是以大腸桿菌中70 kDa的σ因子命名，可分為四個亞族：初級σ因子、類初級σ因子、選擇性σ因子以及孢子形成相關σ，其中的初級σ亞家族中的σD（rpod）是最主要的σ因子，負責與細胞生長相關的超過1 000個基因的轉錄控，尤其是與生存相關基因的表達，是調原核生物抗脅迫的最佳對象[4-6]，被廣泛用于隨機突變篩選高抗脅迫性的突變菌株，取得了較好的應用價值[7-10]。

己酸菌是一類產己酸微生物，在濃香型白酒生產過程中，生活在窖泥和糟醅中的己酸菌，代謝產生的己酸與糟醅中乙醇作用，生成了己酸乙酯，己酸乙酯是濃香型白酒主體香物質，在很大程度上決定著濃香型白酒的品質，因此，提高己酸在糟醅中的濃度是提高濃香型白酒質量的關鍵[11-12]。由于濃香型白酒發酵過程中，低酸度和高乙醇濃度等脅迫條件的限制，己酸生長和代謝受到嚴重影響，因此，如何增強己酸菌的抗脅迫能力，日益成為提高己酸菌產己酸特性的理論和技術依據。

本研究擬采用基因工程的方法，以產己酸菌的Lysini bacillusfusiformis為出發菌，克隆其轉錄調節因子rpod基因SigA，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中誘導表達，并進行實物信息學分析，以期為構建原位超表達SigA工程菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

菌株Lysinibacillusfusiform is：本實驗室保存；pET32（+）：重慶富進生物醫藥工程公司范開教授惠贈提供。

1.1.2 試劑

細菌基因組提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司；2×TSINGKEMaster M ix（blue）聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增試劑盒、DL2000和感受態細胞BL21（DE3）：北京擎科新業生物技術有限公司；限制性內切酶XbaI和Hind III：美國Fermentas公司；TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2.1：寶生物工程（大連）有限公司；GeneRulerTMDNA Ladder M ix（100～10 000 bp）：美國Thermo Fisher Scientific公司；DL15000 Plus：瑞楚生物科技有限公司；蛋白質分子質量標準：碧云天生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：成都科龍試劑廠。

1.2 儀器與設備

BSD-YF3600全溫培養搖床：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：金壇市良友儀器有限公司；SCIENTZ.IID超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技有限公司：759MC紫外可見分光光度計：上海箐海儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；梯度PCR儀：杭州艾普儀器設備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因SigA表達載體的構建

（1）引物設計及合成

采用引物設計軟件，根據NCBI數據庫中L.fusiform is SigA序列，設計PCR引物：上游引物為GTACCCGGGGA TATCTCTAGAATGGCGGACAAGTCAGAACG，下游引物為GACACTATAGAATACAAGCTTTTATTCTAAGAA GTCTTT TAGACGTTTACTACG。上下游引物斜體部分分別為XbaI和HindII酶切位點，將設計引物送上海捷瑞生物技術公司合成。

（2）L.fusiform is基因組DNA的提取

取L.fusiformis甘油菌，在固體乙酸鈉培養基上劃線培養，3 d后挑單菌落入乙酸鈉液體培養基中，34℃、0.08MPa條件下靜置培養8～10 d，采用細菌基因組提取試劑盒進行L.fusiform is總基因組提取，并進行基因組濃度測定。

（3）基因SigA的PCR擴增及純化

以L.fusiform is總基因組DNA為模板，建立PCR反應體系：上、下游引物（10μmol/L）各1μL，2×TSINGKEMaster M ix 25μL，總DNA 1μL，ddH2O 22μL，總體積50μL；反應條件：95℃、3min，95℃、24 s，60℃、25 s，72℃、60 s，72℃、5m in，32個循環，PCR產物結束后，采用天根公司普通產物純化試劑盒進行PCR產物純化。

（4）基因SigA的PCR純化產物的雙酶切及與原核表達質粒pET32a（+）的連接

基因SigA的PCR純化產物和pET32a（+）按Fermentas XbaI和Hind III提供的反應體系和條件進行雙酶切，酶切產物進行1%瓊脂糖電泳，并進行酶切產物的純化；將目的基因與pET32a（+）片段按照DNA Ligation KitVer.2.1使用說明書提供的方法進行連接，并將連接產物轉染BL21(DE3），篩選陽性克隆，進行菌落PCR，挑取菌落PCR驗證正確的菌落至3m L含100μg/m L氨芐青霉素LB培養基中，37℃、200 r/min過夜培養，采用天根公司質粒小提試劑盒提取質粒，進行雙酶切驗證，將酶切驗證正確的質粒，送上海生工工程公司測序，測序結果采用Chromas2.41軟件進行分析。

1.3.2 基因SigA的誘導表達

挑pET-rpod單克隆至5m L 100μg/m L的氨芐青霉素LB培養基中，培養16 h后，按1∶20接種至5m L 100μg/m L的氨芐青霉素LB培養基，37℃、180 r/min培養2.5 h，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）至終濃度為1mmol/L，30℃、180 r/m in繼續培養OD值至0.4～0.6，后放置于冰上過夜。

取上述培養液1m L，4℃、10000g×離心10m in，去上清，加入8mol/L尿素，煮沸6～8min至菌液澄清，冷卻至室溫，10 000 g×離心5min，取60μL上清，加10μL 5×buffer，煮沸3～5m in，冷卻至室溫，取10μL上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacry lam ide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.3.3 基因SigA的生物信息學分析

采用NCBI的blast工具繪制L.fusiformis SigA基因系統進化樹；運用Expasy tool軟件分析L.fusiform is rpod理化性質、疏水性。

采用在線工具預測L.fusiformis rpod因子的二級結構，采用Phyre2軟件構建L.fusiformis rpod三維結構，并運用分子動力學程序中的SPC（simple pointcharge）水模型、GROMOS54A7 force field力場、在溫度為300K條件下，做步長為1ns分子動力學模擬優化，并取出最后一組坐標生成程序數據庫文件（program database file，PDB），采用Discovery studio2.5軟件對優化后的結果進行拉曼分析。

2 結果與分析

2.1 L.fusiform is SigA基因的克隆

以L.fusiformis基因組DNA為模板，擴增SigA基因。結果見圖1。

圖1 PCR擴增產物增凝膠電泳圖Fig.1 Gelelectrophoresis of PCR amp lification products

由圖1可知，經1%凝膠電泳鑒定擴增產物大小為1 140 bp左右，與理論值相符。

2.2 L.fusiformis SigA基因表達載體pET-SigA的構建

目的基因轉化后陽性克隆的菌落PCR和其質粒雙酶切結果分別見圖2和圖3。

圖2 菌落PCR凝膠電泳圖Fig.2 Gelelectrophoresis of colony PCR products

由圖2可知，泳道1菌落為pET-rpod陽性克隆。由圖3可知，酶切產物符合pET32（+）和SigA基因大小，因此，菌落PCR和雙酶切結果表明，pET-SigA表達載體初步構建成功。將菌落PCR鑒定正確的菌落搖菌后取1m L菌液送上海生工工程公司進行進一步測序鑒定。

圖3 質粒雙酶切電泳圖Fig.3 Double enzyme digestion of plasm id

2.3 基因SigA的表達

基因SigA重組表達細菌株與空載體細菌株IPTG誘導表達后，上清進行SDS-PAGE，結果見圖4。

圖4 SigA基因的表達Fig.4 Expression o f gene SigA

由圖4可知，pET-SigA重組菌株表達蛋白質分子質量大小在45 kDa左右，符合rpod大小特征，且其表達量明顯高于對照組（BL21空載體組），表明SigA基因在大腸桿菌中得到超表達。

2.4 以L.fusiform isSigA基因序列為基礎的系統進化樹分析

將rpod基因測序結果采用NCBI中blast工具獲得不同物種序列，選取其中與L.fusiformis SigA基因序列覆蓋度超過75%的序列，采取鄰位連接法（neighbor-joining）構建系統進化樹，結果見圖5。

圖5 L.fusiform is以SigA基因序列為基礎的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of L.fusiform is based on gene SigA

由圖5可知，L.fusiform is與Lysinibacillus sphaericus和Lysinibacillus varians GY32菌株具有較近的親緣關系，其相似度分別達97%和87%，三者間只有點突變，沒有插入或缺失突變。

2.5 L.fusiform is rpod的理化性質

對L.fusiformisSigA基因序列首先采用expasy translate軟件采用獲得氨基酸序列，結果見圖6，并運用expasy protparam軟件進行蛋白質理化性質分析。

圖6 L.fusiform is rpod氨基酸序列Fig.6 Am ino acid sequence of rpod in L.fusiform is

由圖6可知，L.fusiform is rpod具有375個氨基酸，分子質量為45.275 kDa；理論等電點為4.73；在波長280 nm時，其消光系數為19 940 L/（mol·cm）；在大腸桿菌的體內的預測半衰期＞10 h；其不穩定指數為52.65，屬于不穩定蛋白；脂肪族氨基酸指數為89.05，這是由于分子中含有較多的谷氨酸和精氨酸所致。

2.6 L.fusiform is rpod氨基酸序列相似性分析

采用NCBIblast工具，獲得L.fusiform is rpod的同源序列，將其與其他細菌σ70序列采用軟件進行UPMAG聚類分析，結果見圖7。

圖7 L.fusiform is rpod與其細菌σ70的UPMAG聚類分析Fig.7 UPMAG cluster analysis o f rpod in L.fusiform is and bacteriaσ70

由圖7可知，L.fusiform is rpod的氨基酸序列與Bacillus sp.B14905的rpod序列最相似，二者相似度達100%；與Lysinibacillus macroides、Lysinibacillus sphaericus、Lysinibacillus sp.FJAT-14222、Lysinibacillus sp.AC-3和Lysinibacillus xylanilyticus的σ70的相似性也達99%，表明Lysinibacillusfusiform is rpod氨基酸序列同源性高，也說明σ70在進化過程中比較保守。

2.7 親疏水性分析

采用軟件分析L.fusiform is rpod的親疏水性，結果見圖8。

圖8 L.fusiform is rpod的親疏水性Fig.8 Hydrophily and hydrophobicity of L.fusiform is rpod

由圖8可知，L.fusiform is rpod分子其中親水性最高的氨基酸為多肽鏈上137位的谷氨酸，其親水性分值高達-2.833；疏水性最高的是位于多肽鏈149和150位的亮氨酸和纈氨酸，其疏水性分值為1.5；該蛋白總的親水性平均系數為-0.705，預測該蛋白屬于親水性蛋白。

2.8 二級結構預測

L.fusiform is rpod的二級結構預測結果見圖9。

圖9 L.fusiform is rpod二級結構預測Fig.9 Secondary structure prediction of L.fusiform is rpod

由圖9可知，L.fusiformis rpod因子分子中α-螺旋占60.15%，loop環狀結構占37.79%，β-折疊股占僅2.06%。2.9三級結構預測

預測并優化的L.fusiform is rpod三維結構見圖10A，其拉曼圖分析結果見圖10B。

由圖10A可知，模擬的L.fusiform is rpod三級結構與模板分子pdb數據庫中的5UH8均為只有螺旋和環這2種二級結構，α-螺旋均為14個，15個loop，說明本研究預測結果與晶體結構較相符合；由圖10B可知，其拉曼圖中蛋白質分子325個氨基酸中有4個分子處于不允許構象，其允許構象達98.77%，表明本研究模擬結構合理。

圖10 L.fusiform is rpod三級結構預測、優化及評價Fig.10 Tertiary structure prediction,optim ization and evaluation o f L.fusiform is rpod

3 結論

rpod是微生物啟動轉錄過程管家轉錄調節因子，調節細胞內近1 000個基因的表達，在對抗微生物環境脅迫的過程中起了關鍵的作用，因此，對該基因進行遺傳修飾并定向篩選有利突變，實現在轉錄組水平上改造微生物表型的分子育種新方法[13-14]。

本研究利用瀘州老窖180余年老窖池窖底泥分離的產己酸菌Lysinibacillusfusiformis克隆了rpod轉錄因子基因SigA，測序結果表明，基因ORF有1 128個堿基，編碼327個氨基酸，其分子質量為45.275 kDa，該蛋白在BL21細胞中成功進行了表達，表明蛋白質主要以可溶性蛋白形式存在。進一步，采用鄰位連接法建立該基因系統進化樹，表明該L.fusiformis與Lysinibacillus sphaericus和Lysinibacillus varians GY32具有較近的親緣關系；理化分析表明，該轉錄因子為親水性蛋白，其中親水性最高的氨基酸為多肽鏈上137位的谷氨酸，其親水性分值達-2.833；對該蛋白的二級結構分析表明，該蛋白主要由α-螺旋構成和loop環狀結構構成，二分別占60.15%和37.79%；拉曼圖分析結果表明，該模擬結構合理，符合立體化學規則。由于，目前對產己酸微生物主要集中于生產應用研究，對轉錄調節因子研究較少，因此本研究將為rpod轉錄因子在產己酸微生物菌種改良方面研究提供理論和應用依據。

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Cloning,expression and bioinformaticsanalysisofgene SigA in hexanoic acid-producing Lysinibacillusfusiform is

XUEZhengkai1,2,XUEYuan3,YANGGenqing4,ZHANG Suyi5,NIBin5,6
(1.SchoolofLiquor-making Engineering,Luzhou Vocationaland TechnicalCollege,Luzhou 646001,China;2.Institute ofBiomedical Engineering,Luzhou 646000,China;3.SchoolofChemicalScience and Engineering,TongjiUniversity,Shanghai200016,China; 4.Departmentof Inspection,the Third Affiliated HospitalofXingxiang MedicalUniversity,Xinxiang 453003,China; 5.Luzhou Laojiao Group Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;6.Luzhou Jiangtanjiao Co.,Ltd.,Luzhou 646300,China)

The full-length of gene SigA,which encodes transcription factor rpod,was cloned from hexanoic acid-producing Lysinibacillus fusiform is, meanwhile,the expression and bioinformatics analysiswere carried out.The results demonstrated that the open reading frame(ORF)of gene SigA contained 1 128 bases,encoded 327 am ino acids and itsmolecularmass was 45.275 kDa.The bioinformatics prediction results showed that L. fusiform is and Lysinibacillussphaericus had a closegenetic relationship,and the similarity was97%.The predicted protein wasa hydrophilic soluble protein,and the similarity to Bacillus sp.B14905wasup to 100%.Thesecondary structurewasmainly composed ofalphahelix and loop ring,two of whichwere60.15%and 37.79%,respectively.The predicted and optimized tertiary structure consisted of14 alpha-helix and 15 loops.

hexanoic-acid producing bacterium;Lysinibacillusfusiformis;SigA;bioinformatics

TS262.1

0254-5071（2017）08-0120-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.026

2017-05-31

四川省科技支撐計劃項目（NO.2014FZ0018）；瀘州市生物工程研究所重點項目（BME201702）

薛正楷（1968-），男，副研究員，博士，研究方向為微生物代謝工程。