基于假單胞菌生長模型預測冷卻牛肉的貨架期

劉亞兵，何臘平，2*，高澤鑫，高冰，劉涵玉

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068）

基于假單胞菌生長模型預測冷卻牛肉的貨架期

劉亞兵1，何臘平1，2*，高澤鑫1，高冰3，劉涵玉1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068）

假單胞菌（Pseudomonas spp.）的生長繁殖是影響冷卻牛肉貨架期的重要因素。為確定假單胞菌為冷卻牛肉的特定腐敗菌并建立其貨架期預測模型，將屠宰后的冷卻牛肉4℃貯藏，測定了假單胞菌數量與菌落總數、揮發性氨基氮（TVBN）值、顏色明度值（L*）及感官評定分值等品質指標，并確定了冷卻牛肉的假單胞菌腐敗限控量。將冷卻牛肉分別置于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃和25℃條件下進行假單胞菌計數，建立Gompertz方程的初級生長模型和二級模型，并進行了模型的驗證，建立了貨架期預測模型。研究表明，Gompertz預測模型能有效預測4～25℃條件下假單胞菌在冷卻牛肉中的生長情況，在0℃、5℃和10℃溫度條件下，對牛肉貨架期進行驗證，與實際貨架期相比偏差＜1 d，表明貨架期預測模型適用。

冷卻牛肉；假單胞菌；Gompertz模型；貨架期

在肉類行業發展中，牛肉是我國僅次于豬肉消費的第二大肉類食品，而在國外則是主要的肉類[1]。牛肉具有高蛋白、低脂肪的優點，廣受消費者的青睞。冷卻牛肉又稱冷鮮牛肉，是牛肉宰后使胴體深層溫度在24 h內降至0～4℃，并保持在該溫度下貯藏的一類肉品。冷卻牛肉口感細膩、滋味鮮美并且有著較高營養價值的優點，代表著牛肉行業消費和生產的發展方向[2]。近年來，冷卻牛肉的消費在我國呈上升的趨勢。但其水分活度高，營養豐富，極易受微生物的污染，微生物是導致肉類腐敗變質的主要原因之一，在低溫貯藏條件下，假單胞菌（Pseudomonas spp.）是導致肉類腐敗變質的主要腐敗菌，嚴重影響牛肉的品質[3]。因此，對冷卻牛肉貨架期的預測探究越來越受到消費者的關注，由于我國肉類研究貯藏體系的不完善，使得貯藏溫度經常異常波動，在實際冷卻貯藏和銷售過程中，往往溫度會偏高，使得牛肉中微生物會迅速繁殖，從而影響牛肉產品的安全，因此，對肉類中微生物生長的預測直接關系著肉類的質量安全及其貨架期的壽命。目前，在變溫條件下，通過預測微生物生長來反應肉類貨架期的研究還很少，在冷卻牛肉貨架期方面的研究還僅處于起步階段[3]。

假單胞菌是能引起冷卻肉類腐敗變質的主要微生物之一[4-5]，因此，冷卻肉類中假單胞菌的生長繁殖直接關系到肉類的貨架期壽命。很多研究學者表明，假單胞菌在有氧條件下生長，具有致腐的特性，田璐等[6]指出，冷卻肉類貯藏在有氧條件下，其腐敗主要是由需氧型假單胞菌大量繁殖引起的，與假單胞菌有較強的利用肌氨酸的能力有關[7]。假單胞菌的生長需要肉類中的碳源與能源，在適宜的條件下，假單胞菌生長達到一定數量時，冷卻牛肉中碳源不能滿足其生長生理的需求，隨后假單胞菌就會利用冷卻牛肉的氨基酸作為生長營養基質，肉類的氨基酸分解利用將會產生一些帶有異味的物質，如含硫化合物、酯、酸等。在對肉類腐敗評估中，其葡萄糖無疑被認為是一種能預測腐敗水平的重要指標。實際上，冷卻肉類的腐敗及貨架期壽命，主要是由于肉類中腐敗菌特別是假單胞菌的生理行為及其新陳代謝作用所導致[8]。

貯藏的環境溫度也是影響冷卻牛肉貨架期的長短重要因素[9-10]。為有效控制冷卻牛肉的腐敗并使其具有較長的貨架期，探究導致牛肉品腐敗的微生物生長預測及繁殖規律是有必要的，在變溫度條件下來對微生物生長的預測，微生物預測模型可以快速有效的解決這一問題。確定冷卻牛肉中的特定腐敗菌是建立良好假單胞菌生長預測模型的基礎。為了證實假單胞菌為低溫貯藏條件下冷卻牛肉的特定腐敗菌[11-13]，將冷卻牛肉分別置于0、5℃、10℃、15℃、20℃和25℃條件下，進行假單胞菌活菌計數，建立Gompertz方程[14]的一級生長預測模型和二級生長模型，通過預測模型的驗證，建立冷卻牛肉的貨架期預測模型。因此，本研究建立了不同溫度條件下冷卻牛肉中假單胞菌的生長模型，進行模型的驗證并做了合理性的解釋，為冷卻牛肉的發展，更好地抑制冷卻牛肉中假單胞菌的生長提供了理論基礎，以避免牛肉中假單胞菌的污染而造成的牛肉安全問題[15-16]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據國標GB/T 17238—2008《鮮、凍分割牛肉》中要求，多次從貴陽市花溪區星力超市采樣，每次隨機選取10條常規屠宰分割的牛臀肉，貯藏在（0～4）℃條件下2 h內帶回實驗室。

假單胞菌培養基：蛋白胨16.0 g；水解酪蛋白10.0 g；無水硫酸鉀10.0 g；氯化鎂1.4 g；甘油10.0m L；假單胞菌培養基選擇劑含氯氟烴（chlorofluorocarbon，CFC）1支/200m L；pH值7.0±0.2；蒸餾水1 000m L。

平板計數培養基（plate countagar，PCA）：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸粉2.5 g；葡萄糖瓊脂15.0 g；蒸餾水1 000m L；pH 7.0±0.2。

1.2 儀器與設備

SPX-400智能型生化培養箱：上海科恒實業發展有限公司；JM-A2002電子天平：余姚記銘稱量股份有限公司；SW-CJ-10超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；BCD-278TAJ低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；SFY 8931081水分測定儀：深圳市冠亞水分儀儀器有限公司；JM-AI5002便攜式色差儀：余姚市紅銘稱重校驗設備公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

從超市采樣，每次隨機選取10條常規屠宰分割的牛臀肉，0～4℃冷藏條件下2 h內帶回實驗室。隨機分成3組，每組3條。在無菌條件下將每條牛臀肉修去筋腱后，垂直于肌纖維方向切成30 cm2大小，厚約2～3 cm的肉塊。將每一個肉塊分別用低密度的保鮮袋包裝，放在4℃條件下分別貯藏0、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d。

1.3.2 菌落總數、假單胞菌數的測定

在無菌環境下進行計數實驗，每隔相應時間段取3份肉樣25 g置于錐形瓶中，加入225m L無菌生理鹽水中并密封好，用搖床搖1 h左右，然后按10倍稀釋梯度，每個稀釋度取100μL樣液涂布于培養基表面，共取3個稀釋度，每個稀釋度做3個重復，進行假單胞菌數的測定，細菌總數的測定按照GB/T 4789.2—2008《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》中的方法進行。

1.3.3 揮發性鹽基氮的測定

在規定的時間段，取牛肉樣10 g絞碎攪勻，置于錐形瓶中，加入100m L蒸餾水備用。按GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》微量擴散法測定揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量。

1.3.4 顏色明度值的測定

每隔相應時間取相應肉樣用便攜式色差儀測國際照明委員會（Commission Internationale de L'Eclairage，CIE）表示顏色亮度的L*值，每個樣品至少測定3次，取平均值。1.3.5感官評定

由10名評價員組成感官評價小組，以對肉的氣味、色澤、黏度、組織狀態、煮沸后肉湯及綜合評價進行打分。采用一種相對簡單的7分法（分值越低表明感官評價越高），1分表示最好的牛肉品質，7分表示腐敗牛肉，不可食用，即可接受界限。評定方法按GB 17238—2008《鮮、凍分割牛肉》中的方法執行。

1.3.6 數據處理

本試驗數據采用SPSS 20.0，OriginPro9.0軟件進行分析，各指標數據采用SPSS 20.0統計軟件進行相關分析和聚類分析，采用OriginPro9.0、Matlab7.0軟件進行模型擬合和回歸分析。

1.3.7 假單胞菌的生長模型的建立及驗證

（1）假單胞菌生長的動力學模型（一級模型）

分別在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃和25℃條件下，通過平板計數法測量假單胞菌生長量，用Gompertz方程[17]預測變溫條件下假單胞菌的生長情況，其一級模型表達式如下：

式中：Nt為貯藏時間為t時的微生物數量對數值；N0為初始時微生物數量對數值；Nmax為穩定期時微生物的最大微生物數量對數值；μm為微生物生長的最大比生長速率，h-1；t為貯藏時間，h；tb是微生物生長延遲期的時間，h。

（2）假單胞菌生長的動力學模型（二級模型）

微生物生長預測二級模型方程的使用和研究都比較廣泛，在描述不同溫度對微生物生長的影響動力學模型常用Belehradek方程來描述，表達式如下：

式中：μm是一級模型求出的生長速率，h-1；λ是模型待求的參數，℃-1h0.5；Tmin是理論上的最小生長溫度，K；T是微生物生長的特征溫度，K；tb是微生物生長延遲期的時間，h。

（3）假單胞菌生長模型的可靠性評價和驗證

通過建立的假單胞菌生長預測模型可求得在5℃和15℃貯藏時假單胞菌數的預測值與實際檢測的假單胞生長數進行比較，采用偏差度（bias factor，Bf）及準確度（accuracy factor，Af）來評價己經建立的特定腐敗微生物生長動力學模型的可靠性[18]。偏差度及準確度表達式如下：

式中：Nact是實驗實際測得的假單胞菌數量，CFU/g；Npre是應用假單胞菌生長預測模型預測的數量，CFU/g；n是實驗次數，次。

（4）貨架期預測和驗證

冷卻牛肉貨架期[3]（shelf life，SL），根據所建立的特定腐敗假單胞菌生長預測模型，可通過該特定腐敗菌量從（N0）增值到（Ns）所需要的經歷時間來進行預測。貨架期表達式如下：

式中：Ns為時的微生物數量對數值；N0為初始時假單胞菌數量對數值；Nmax為穩定期時期假單胞菌最大菌量的對數值；μm為假單胞菌生長的最大比生長速率，h-1；tb微生物生長延遲期的時間，h。

隨機取貯藏在5℃和15℃溫度條件下的冷卻牛肉，根據實際冷卻牛肉的貨架期與所建模型預測的貨架期進行比較，評價所建立貨架期預測模型的可靠性及使用性。

2 結果與分析

2.1 假單胞菌與各品質指標的相關性分析

如表1所示，牛肉在4℃貯藏期間，假單胞菌數量與TVBN值、L*值、感官評分以及菌落總數的相關系數分別為0.871（P＜0.01）、-0.847（P＜0.01）、0.984（P＜0.01）、0.985（P＜0.01）說明兩兩高度相關。

表1 冷卻牛肉在4℃貯藏下各品質指標的皮爾遜相關系數Table 1 Pearson correlation coefficient of qua lity indicators of chilled bee f stored at 4℃

由表1可知，假單胞菌的生長與牛肉在4℃貯藏期間的細菌總數、感官評定、TVBN及L*值等多種品質指標均顯著相關，并且假單胞菌、菌落總數與各腐敗指標的相關系數均大于其他指標的相關系數，因此可以判定假單胞菌為冷卻牛肉的特點腐敗菌，以其生長模型預測在有氧貯藏條件下，對冷卻牛肉的腐敗程度的預測具有可行性。

2.2 假單胞菌的腐敗限控量的確定

選用冷卻牛肉中假單胞菌總數、菌落總數、TVBN值、L*值及感官評定值作為冷卻牛肉不可接受的判斷指標。

如表2所示，假單胞菌數量在前8 d逐漸增加且增幅較大，8 d之后基本處于穩定狀態；而TVBN值在貯藏的前8 d變化不大，基本在14mg/100 g左右，但到了第10天變化很大升至16.85mg/100 g，超過GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產品》中規定TVBN值≤15mg/100 g的標準；L*值前期基本處于39左右，但到了8 d之后顏色亮度值呈下降趨勢；感官評定值在第10天已經接近4.5分，達到了不可接受值，表明此時的冷卻牛肉已經變質不可食用。

聚類分析是研究“物以類聚”的一種科學有效的方法，由試驗測試得到的數據是原始數據，原始數據是沒有進行分類的、無規律的、錯綜復雜的變量，要使得這些數據能夠反映出一定的規律性或特殊的分類性，需要對數據或變量進行聚類分析，以使數據或變量呈現一定的分門別類的特征。結合聚類分析的特征，將各指標數值通過OriginPro9.0統計軟件進行聚類分析，結果見圖1。

表2 4℃貯藏冷卻牛肉各品質指標Table 2 Quality indicators of chilled beef stored at 4℃

圖1 冷卻牛肉貯藏時間的聚類分析Fig.1 Cluster ana lysis of chilled beef during storage tim e

由圖1可知，冷卻牛肉貯藏前8 d的被聚為一類，10～16 d的聚為一類，結合菌落總數、感官評定值及TVBN值可以判斷前8 d的牛肉為可接受的牛肉，之后為不可食用的冷卻牛肉。由表1和表2可以知，假單胞菌與各指標相關性極顯著（P＜0.01），再結合圖1冷卻牛肉的貯藏時間聚類分析，當貯藏第8天時，可得出假單胞菌數量對數值為7.54（3.5×107CFU/g）作為冷卻牛肉的腐敗控量。這一結果與劉婷婷等[19]所得假單胞菌達107～109CFU/g牛肉貨架期終了的結論是相符合的。

2.3 模型的建立與驗證

2.3.1 假單胞菌生長的動力學模型（一級模型擬合）

在變溫條件下，根據測定假單胞菌活菌數的結果，采用Matlab7.0軟件進行模型擬合和回歸分析，擬合貯藏不同溫度條件下假單胞菌生長的一級模型，繪制了在不同溫度條件下的時間-假單胞菌總數曲線，得到在不同溫度條件下的生長曲線，結果見圖2，相應Gompertz擬合方程為：

在不同貯藏溫度下，由于假單胞菌的生長呈S型曲線，由圖2可知，Gompertz模型方程能很好的擬合假單胞菌的生長情況，隨著貯藏溫度的不斷升高最大假單胞菌數的時間依次減小，貯藏條件0℃時最長約為400 h，25℃最短僅為70 h左右。

圖2 不同溫度貯藏條件下冷卻牛肉中利用Gom pertz方程擬合的假單胞菌生長曲線Fig.2 Grow th curve of Pseudom onads spp.in chilled beef under different tem perature conditions by Gompertz equation fitting

在不同貯藏溫度下，根據假單胞菌各指標數測定結果，通過SPSS 20.0統計軟件進行處理分析結果見表3。

由表3可知，溫度對假單胞菌生長的影響，Gompertz方程擬合的初始菌數對數值在3.19～3.59，最大菌數集中在9.00。最大比生長速率隨溫度的升高而升高，延遲期的時間隨溫度的升高而減少。可以看出模型擬合的R2均＞0.95且均方誤差（mean squared error，MSE）較小，說明兩者均擬合得很好，表明Gompertz方程能很好的應用于對假單胞菌的預測。

表3 由Gompertz方程得出在常溫（變溫）貯藏下初始霉菌數、最大菌數、最大生長速率、延遲時間、均方誤差和相關系數Table 3 Initialnumber ofmolds,m axim um num ber of bacteria, maximum grow th rate,delay time,MSE and R2at norma l temperature(varying tem perature)storage by the Gompertz equation

2.3.2 假單胞菌生長的動力學模型（二級模型擬合）

根據求得的假單胞菌在不同溫度下的最大比生長速率，利用OriginPro9.0統計軟件擬合最大比生長速率-溫度（μm1/2-T），結果見圖3。由圖3可知，得到二級模型，μm1/2= 0.134+0.010T（P＜0.01，R2=0.964），即：μm1/2=0.010[T-（-13.4）]。由二級模型μm1/2=λ（T-Tmin），可知假單胞菌的λ=0.010，假單胞菌延滯時間的擬合結果為：tb-1/2=0.065 0+0.024 2T。

圖3 假單胞菌的生長速率與溫度的擬合關系Fig.3 Fitting relationship between grow th rate and tem perature of Pseudomonas spp.

溫度與比生長速率平方根模型的殘差值，結果見表4。由表4可知，其殘差的絕對值均＜0.05，說明擬合的模型關系比較合理，說明假單胞生長的平方根預測模型能較好的描述變溫條件下對假單胞菌生長的影響。

表4 貯藏溫度與比生長速率平方根模型的殘差值Table 4 Residualvalue of square rootm odelof temperature and specific grow th rate

2.3.3 模型的驗證

在5℃和15℃條件下的預測值和實際所得貯藏過程的真實值來計算所得的預測方程的偏差度（Bf）和準確度（Af），所得的準確因子為1是模型擬合最理想效果，結果見表5。

表5 冷卻牛肉在5℃和15℃貯藏時微生物數量預測值的偏差度和準確度Tab le 5 Deviation and accuracy of the m icrobes num ber prediction in chilled beef at 5℃and 15℃

由表5可知，預測值上下波動的幅度（即Bf）為10%左右，預測值和實測值之間的差異（即Af）介于15%以內，表示誤差比較低，建立的數學模型能很好的預測特定腐敗微生物在5℃和15℃條件下的生長動態。

2.3.4 貨架期預測模型的建立

根據建立的假單胞菌生長預測模型，可以用假單胞菌這一特定腐敗菌從初始菌數（N0）增殖到最小腐敗量（Ns）所需的時間來預測0～25℃有氧貯藏牛肉的貨架期。冷卻牛肉的最大假單胞菌數（N0）對數值為7.54；最大菌落總數對數值約為9.00。因此，只要實時測量冷卻牛肉的初始假單胞菌總數，就可以預測在0～25℃有氧貯藏牛肉的貨架期，其表達式如下：

2.3.5 貨架期預測模型的驗證

隨機從不同采集地方買回的鮮牛肉，一組放置在0℃、5℃和10℃貯藏溫度條件下，另一地的鮮牛肉貯藏在15℃、20℃和25℃，取相應肉樣進行初始假單胞菌數的測定計數，隨著貯藏時間的延長，基于感官評分對鮮牛肉貨架期進行預測，貨架期模型預測的貨架期與實際鮮牛肉的貨架期比較結果見表6。

表6 貨架期的預測值與實際貨架期比較Table 6 Com parison of prediction va lue and actualvalue of the shelf life

由表6可知，在0℃、5℃及10℃有氧貯藏條件下測定冷卻牛肉的貨架期，通過對牛肉剩余貨架期預測值與實際貨架期對比發現偏差都小于1 d，說明所建立的貨架期模型可行性較好，適用價值高。

3 結論

假單胞菌的生長與冷卻牛肉中菌落總數、TVBN值、L*值及感官評分[20-21]等多種品質指標的相關性顯著（P＜0.01），因此可以判定假單胞菌為冷卻牛肉的特定腐敗菌，在有氧貯藏冷卻牛肉條件下，假單胞生長預測模型可以確定腐敗限量，通過可行性聚類分析及綜合各指標結果得出冷卻牛肉中假單胞菌的限控量為3.5×107CFU/g。通過假單胞菌生長Gompertz方程的一級、二級模型擬合，對研究低溫貯藏條件下冷卻牛肉的生長情況進行評估，在0℃、5℃及10℃有氧貯藏條件下測定冷卻牛肉的貨架期，預測結果跟實際貯藏結果偏差不到1 d，表明所建的貨架期模型可行性較高，在變溫條件下，為實時求得冷卻牛肉的貨架期奠定了理論基礎。所建立的假單胞菌生長動力學模型可以快速可靠地實時預測假單胞菌在牛臀肉中的生長動態，可以為冷卻牛肉中假單胞菌污染時的預測和監控提供有效的工具，以提高冷卻牛肉質量的安全性[22]。

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Prediction ofshelf life of chilled beefbase on Pseudomonas spp.grow thmodel

LIU Yabing1,HE Laping1,2*,GAO Zexin1,GAO Bing3,LIU Hanyu1
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory ofAgriculturaland AnimalProductsStore&Processing ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.College ofBioengineering and Food Science,HubeiUniversity ofTechnology,Wuhan 430068,China)

The grow th of Pseudomonas spp.is the important factorsaffecting the shelf life of chilled beef.In order to determine the Pseudomonas spp. asspecific spoilageorganismsof coolbeef,theshelf life predictionmodelwasestablished.Chilled beefafter slaughterwasstorageat4℃,thenumber of Pseudomonas spp.,totalnumber of bacterial colony,total volatile basic nitrogen(TVBN)value,chromatic aberration L*value,sensory score and other quality indicatorswere determ ined,and the corruption control quantity of Pseudomonas spp.in chilled beef were determ ined.The number of Pseudomonas spp.in chilledbeefstoredat0℃,5℃,10℃,15℃,20℃and25℃wascounted respectively.Theprimarygrow thmodeland thesecondary model of Gompertz equation were established and verified,and the shelf life prediction modelwas established.The results showed that Gompertz predictionmodelcould effectively predict thegrow th situation of Pseudomonas spp.in chilled beef stored at4-25℃.Under the conditionsof0℃,5℃and 10℃,theprediction shelf lifewas less than 1 d compared to theactualshelf life,which indicated thatshelf life predictionmodelwasapplicable.

chilled beef;Pseudomonas spp.;Gompertzmodel;shelf life

TS251.8

0254-5071（2017）08-0114-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.025

2017-05-10

貴州省農業攻關項目（黔科合重大專項字[2015]6004-5號）；貴州省農業攻關項目（黔科合支撐[2016]2580號）

劉亞兵（1991-），男，碩士研究生，研究方向為食品科學及食品微生物。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、生物催化與生物轉化。