冠突散囊菌發(fā)酵燕麥對多酚含量影響的研究

王家琛，劉素純*，劉善鑫

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

冠突散囊菌發(fā)酵燕麥對多酚含量影響的研究

王家琛，劉素純*，劉善鑫

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128）

以燕麥為原料，采用冠突散囊菌（Eurotium cristatum）發(fā)酵燕麥，探討燕麥多酚的提取工藝以及發(fā)酵條件對多酚含量的影響。結(jié)果表明，多酚提取工藝條件為燕麥料液比1∶16（g∶m L），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提溫度45℃，浸提時(shí)間60min。在此最佳提取工藝條件下，多酚含量可達(dá)1.48mg/g。冠突散囊菌發(fā)酵燕麥的發(fā)酵條件為燕麥料液比1∶1.0（g∶m L），接種量2%，28℃發(fā)酵4 d。在此最佳發(fā)酵條件及提取工藝條件下，多酚含量最高可達(dá)2.28mg/g。經(jīng)發(fā)酵后的燕麥多酚含量明顯升高。

冠突散囊菌；燕麥；提取；發(fā)酵條件；多酚含量

燕麥屬于全谷物制品，分為兩大類：皮燕麥（Avena sativa）和裸燕麥（Avenanuda），我國以裸燕麥為主。燕麥在我國人民心中一直是高營養(yǎng)的五谷雜糧，在中國居民平衡膳食寶塔中占據(jù)第一層，主要原因是其含有豐富的生物活性成分如酚類化合物、膳食纖維、維生素、低聚糖、植酸等[1]。研究表明，酚類化合物在食品中具有很強(qiáng)的清除自由基能力，能有效地預(yù)防脂質(zhì)過氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化[2-4]。燕麥中的多酚分為游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚，有研究表明，結(jié)合態(tài)多酚遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離態(tài)多酚的含量[5]，但是游離態(tài)多酚的抗氧化性能優(yōu)于結(jié)合態(tài)多酚[6]。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）俗稱“金花”，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊屬的一種真菌，是茯磚茶在“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌種[7]，且能吸收茶中的營養(yǎng)成分，經(jīng)生物酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有益成分。研究認(rèn)為，冠突散囊菌符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，沒有毒副作用[8]，其菌絲體含有15種氨基酸，能夠滿足人體必需氨基酸的需求[9]。利用冠突散囊菌對不同的培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌的次生代謝產(chǎn)物含有降脂類物質(zhì)洛伐他汀，這種物質(zhì)對高血壓、高血脂、肥胖等富貴病有一定的治療效果[10-11]，此外，在清除自由基方面也存在一定的作用[12]。

在微生物發(fā)酵過程中伴隨著多種生物化學(xué)變化的發(fā)生，分解谷物中的營養(yǎng)大分子，有利于提高谷物中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[13]。利用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）和釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）對蕎麥、小麥胚芽、大麥和黑麥四種谷物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)谷物的總酚含量顯著增加，抗氧化活性增強(qiáng)[14-15]。MOORE J等[16]使用酵母菌固態(tài)發(fā)酵麥麩，發(fā)現(xiàn)麥麩中總酚含量顯著增加，其對過氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及羥基自由基的清除能力明顯提高。KABOM等[15，17]研究發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵能激發(fā)燕麥中多酚類物質(zhì)的抗氧化能力。國內(nèi)外有很多研究人員利用微生物發(fā)酵研發(fā)新產(chǎn)品[18-20]。目前，冠突散囊菌大多應(yīng)用于茶葉方面，在食品方面的應(yīng)用相對較少且還在發(fā)展過程中。本研究利用冠突散囊菌在燕麥上發(fā)花，通過福林酚試劑法，以燕麥多酚含量為評價(jià)指標(biāo)，研究發(fā)酵對燕麥多酚含量的影響，有利于日后開發(fā)燕麥相關(guān)保健產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：黑龍江黑土香燕麥產(chǎn)業(yè)股份有限公司；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：從湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶分離。

福林酚試劑、無水碳酸鈉（分析純）、乙醇（分析純）、甲醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-25085-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FW 135中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTD數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；RXⅡSeries高速低溫冷凍離心機(jī)：HITACHI；722N可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

按麩皮∶水為1∶1（g∶m L）的比例制作培養(yǎng)基裝入500m L三角瓶中，121℃滅菌25m in，接入斜面冠突散囊菌，28℃培養(yǎng)4 d為燕麥冠突散囊菌種子液。

1.3.2 燕麥的冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)

稱取一定量已去雜去劣的裸燕麥，加水浸泡12h。用紗布將水瀝干，分裝于錐形瓶中，121℃滅菌25min。無菌接入冠突散囊菌種子液，搖勻，28℃培養(yǎng)4 d。

1.3.3 發(fā)酵燕麥前處理

將發(fā)酵好的燕麥平鋪白瓷盤，于45℃烘干10 h，烘干后粉碎，過40目篩，得發(fā)酵的燕麥粉置陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 燕麥多酚含量的測定

燕麥多酚含量的測定參照郝教敏等[21]的測定方法。準(zhǔn)確稱取0.010g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解并定容至250m L容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.04mg/m L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0、0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、3.0m L、3.5m L于25m L比色管中，各分別加入蒸餾水至3.5m L，再加入1m L福林酚試劑，靜置3m in，用0.05 g/m L碳酸鈉溶液定容至刻度，搖勻，避光15min后，以未添加沒食子酸的作為空白，于波長765 nm處測定其吸光度值，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多酚含量。

1.3.5 燕麥多酚提取工藝的優(yōu)化

（1）有機(jī)溶劑及體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵燕麥多酚提取的影響

稱取發(fā)酵燕麥粉1.50 g于錐形瓶中，按1∶14（g∶m L）的料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%的甲醇和乙醇，用封口膜封住，置于35℃恒溫水浴中提取1 h。提取后，采用低溫（4℃）10 000 r/m in離心15m in。靜置上清液并記錄體積，待恢復(fù)至室溫，測定其多酚含量。同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

（2）提取溫度對發(fā)酵燕麥多酚提取的影響

稱取燕麥粉1.50 g于錐形瓶中，按1∶14（g∶m L）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，用封口膜封住，分別置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒溫水浴中提取1 h。后續(xù)處理同上。

（3）提取時(shí)間對發(fā)酵燕麥多酚提取的影響

稱取燕麥粉1.50 g于錐形瓶中，按1∶14（g∶m L）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，用封口膜封住，置于45℃恒溫水浴中分別提取40min、50min、60min、70min、80m in、90min。后續(xù)處理同上。

（4）料液比對發(fā)酵燕麥多酚提取的影響

稱取燕麥粉1.50 g于錐形瓶中，分別按1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g∶m L）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，用封口膜封住，置于45℃恒溫水浴中提取1 h。后續(xù)處理同上。

1.3.6 冠突散囊菌發(fā)酵燕麥對多酚含量的影響

（1）不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

將燕麥按1.3.2處理，接種1%的冠突散囊菌發(fā)酵劑，放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)0、2 d、3 d、4 d、5 d，按1.3.3處理后按上述優(yōu)化提取條件測定其多酚含量。

（2）不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

將按1.3.2處理的燕麥，接種1%的冠突散囊菌發(fā)酵劑，分別放入25℃、28℃、30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，測定其多酚含量。

（3）不同接種量對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

按0、1%、2%、3%、4%冠突散囊菌發(fā)酵劑接入1.3.2處理的燕麥中，28℃培養(yǎng)4 d，測定其多酚含量。

（4）不同料液比對發(fā)酵壓扁燕麥多酚含量的影響

將原料燕麥用錘子敲成燕麥片狀，加入不同量的水，使料液比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0（g∶m L），121℃滅菌25m in，接種2%的冠突散囊菌發(fā)酵劑，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，測定其多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

以標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=109.57x+0.009 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 24。結(jié)果表明，二者線性關(guān)系良好。

2.2 不同有機(jī)溶劑及體積分?jǐn)?shù)提取對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

選取不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇及乙醇分別對發(fā)酵燕麥多酚進(jìn)行提取，測定多酚含量結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，體積分?jǐn)?shù)為40%～70%時(shí)，乙醇提取的發(fā)酵燕麥多酚含量高于甲醇，甲醇及乙醇體積分?jǐn)?shù)為76%左右，兩種有機(jī)溶劑的發(fā)酵燕麥多酚提取量相等，體積分?jǐn)?shù)為80%～90%時(shí)甲醇提取發(fā)酵燕麥多酚含量高于乙醇。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為80%、90%的甲醇及體積分?jǐn)?shù)為70%～90%的乙醇進(jìn)行多酚提取時(shí)，顯色反應(yīng)產(chǎn)生明顯絮狀沉淀現(xiàn)象，對其進(jìn)行離心再處理，測定的結(jié)果是多酚含量明顯降低。高濃度的體積分?jǐn)?shù)造成多酚提取率降低，主要是因?yàn)楦邼舛鹊挠袡C(jī)溶劑將某些不確定的脂溶性物質(zhì)提取出來，增加了許多干擾因素，加大了與多酚物質(zhì)競爭溶劑分子的作用，從而影響多酚物質(zhì)的提純[22-23]。因此，考慮實(shí)驗(yàn)效果和操作的可行性，選擇體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為適宜的提取溶劑。

圖2 不同有機(jī)溶劑及體積分?jǐn)?shù)對燕麥多酚含量的影響Fig.2 Effects of different organic so lvent and concentration on oats polyphenol content

2.3 提取溫度對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

圖3 提取溫度對燕麥多酚含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on oats polyphenol content

采用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在不同溫度下對發(fā)酵燕麥多酚提取，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的增加多酚提取的含量呈不規(guī)律的變化，在45℃時(shí)燕麥多酚提取含量達(dá)到最高，溫度再升高多酚提取含量降低。因?yàn)檩^高溫度可以提高溶質(zhì)中多酚物質(zhì)的擴(kuò)散速度，從而促使分子運(yùn)動(dòng)速度加快，易造成氫鍵斷裂，多酚的滲透、溶解速度也隨之加快，酚類物質(zhì)更容易從原料中浸出[24-25]，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，多酚的氧化速度增加，使得提取出的多酚物質(zhì)被氧化而導(dǎo)致結(jié)果降低[26]，故選擇提取溫度為45℃。

2.4 提取時(shí)間對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

在體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇、提取溫度為45℃的條件下，對燕麥多酚進(jìn)行不同時(shí)間的提取，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在40～90m in內(nèi)隨著時(shí)間的延長，多酚的含量先升高后下降，在60m in時(shí)提取的含量達(dá)到最高。一般而言，提取時(shí)間越長，溶解于乙醇溶液中的多酚物質(zhì)越多，得率越大；但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到一定限度，多酚類物質(zhì)基本完全溶于乙醇中，長時(shí)間的提取可能會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的縮合，降低最后的結(jié)果[27]。故選擇提取時(shí)間為60m in。

圖4 提取時(shí)間對燕麥多酚含量的影響Fig.4 Effect o f extraction time on oats polyphenol content

2.5 料液比對發(fā)酵燕麥多酚含量的影響

圖5 料液比對燕麥多酚含量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on oats polyphenol content

在體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇、提取溫度為45℃、提取時(shí)間為60min的條件下，采用不同料液比對燕麥多酚進(jìn)行提取，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，多酚含量在料液比為1∶8～1∶16（g∶m L）范圍內(nèi)逐漸增大；當(dāng)料液比為1∶16（g∶m L）時(shí)，多酚含量達(dá)1.481mg/g；當(dāng)料液比＞1∶16（g∶m L）之后，多酚含量趨于平穩(wěn)。這可能是由于在樣品量相同的條件下，有機(jī)溶劑對多酚的提取量趨于飽和狀態(tài)，對結(jié)果無明顯影響[28]。故選擇料液比為1∶16（g∶m L）。

2.6 冠突散囊菌發(fā)酵燕麥對多酚化合物含量的影響

2.6.1 不同發(fā)酵時(shí)間對燕麥多酚化合物含量的影響

將燕麥按1.3.2處理，按1%接種量接種冠突散囊菌發(fā)酵劑在28℃發(fā)酵0、2 d、3 d、4 d、5 d，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行多酚的提取，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，發(fā)酵初期隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，多酚含量逐漸增加。由于發(fā)酵過程中微生物的代謝活動(dòng)，可使其細(xì)胞壁分解或形成代謝產(chǎn)物，使得結(jié)合態(tài)的多酚不斷釋放或代謝的累積[29]。整個(gè)試驗(yàn)過程，在第4天和第5天多酚含量趨于平緩。故可選擇發(fā)酵時(shí)間為4 d。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對燕麥多酚含量的影響Fig.6 Effects of fermentation time on oats polyphenol content

2.6.2 不同發(fā)酵溫度對燕麥多酚化合物含量的影響

圖7 發(fā)酵溫度對燕麥多酚含量的影響Fig.7 Effects of fermentation temperature on oats polyphenolcontent

將燕麥按1.3.2處理，接種1%的冠突散囊菌發(fā)酵劑在不同溫度下發(fā)酵4 d，測定其多酚含量，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，隨著溫度由25℃升高至30℃，燕麥多酚的含量增加，在30℃時(shí)多酚含量最高，為1.499mg/g。根據(jù)郭勁霞等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，溫度對冠突散囊菌的生長有雙重效應(yīng)，當(dāng)發(fā)酵溫度＞29℃，菌絲干質(zhì)量降低，可能由于溫度在一定程度上會(huì)影響微生物代謝的酶系，從而影響微生物對燕麥營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化[30]。故可選擇28℃進(jìn)行發(fā)酵。

2.6.3 不同接種量對燕麥多酚化合物含量的影響

將燕麥按1.3.2處理，接種不同量的冠突散囊菌發(fā)酵劑，28℃發(fā)酵4 d后測定多酚含量，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，隨著接種量在0～4%范圍內(nèi)增加，多酚含量先升高后降低，在接種量為2%時(shí)多酚含量達(dá)最高值，為1.515mg/g，在該條件下，冠突散囊菌能充分生長繁殖，同時(shí)也有利于多酚物質(zhì)的產(chǎn)出。接種量過大，冠突散囊菌之間對基質(zhì)中的養(yǎng)料及氧氣競爭，影響多酚物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。故選擇接種量為2%進(jìn)行發(fā)酵。

圖8 接種量對燕麥多酚含量的影響Fig.8 Effects o f inoculum on oats polyphenol content

2.6.4 不同料液比對燕麥壓扁后多酚化合物含量的影響

將壓扁后的燕麥加入不同量的水，按2%接種冠突散囊菌發(fā)酵劑在28℃發(fā)酵4 d后，測定多酚含量，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，當(dāng)料液比為1∶0.5（g∶m L）時(shí)，水分含量較少，燕麥相對較干，影響了冠突散囊菌的生長；當(dāng)料液比為1∶1.0（g∶m L）時(shí)，多酚含量最高，達(dá)2.283mg/g；當(dāng)料液比＞1∶1.0（g∶m L）后，燕麥結(jié)塊，燕麥之間的空隙減少，導(dǎo)致整個(gè)基質(zhì)溶氧不足，對冠突散囊菌的生長繁殖造成一定的影響，影響了多酚的產(chǎn)出[30]。故若將燕麥壓成燕麥片形狀時(shí)可選擇料液比為1∶1（g∶m L）進(jìn)行發(fā)酵，此時(shí)也能獲得更多的多酚物質(zhì)。

圖9 料液比對燕麥多酚含量的影響Fig.9 Effect of solid-liquid rate on oats polyphenol content

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，確定了經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵燕麥的多酚最佳提取條件為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，提取時(shí)間60min，料液比1∶16（g∶m L），溫度45℃。按此工藝提取，多酚含量可達(dá)1.481mg/g。冠突散囊菌發(fā)酵燕麥的發(fā)酵條件為燕麥料液比1∶1.0（g∶m L），接種量2%，28℃發(fā)酵4 d。在此最佳發(fā)酵條件及提取工藝條件下，多酚含量最高可達(dá)2.283mg/g，多酚含量經(jīng)過發(fā)酵后明顯提高。冠突散囊菌發(fā)酵對燕麥多酚含量影響的發(fā)酵機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

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Effectof Eurotium cristatum fermentation on polyphenol content in oats

WANG Jiachen,LIU Suchun*,LIU Shanxin
(College ofFood Science and Technology,Hunan AgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

Using the oatsas the raw material,the oatwas fermented by Eurotium cristatum.The effectof extraction processand fermentation conditions on polyphenol contentwas discussed.The results showed that the extraction process conditions of polyphenolwere oats solid-liquid ratio 1∶16 (g∶m l),ethanol concentration 60%,extraction temperature 45℃and time 60min.Under the optimum extraction conditions,the polyphenol content wasup to 1.48mg/g.Theoats fermentation conditionsby E.cristatum wereoatssolid-liquid rate1∶1.0(g∶m l),inoculum 2%,fermentation temperature 28℃and time 4 d.Under the optimum conditions,the polyphenol contentwas up to 2.28mg/g.After fermentation,the oats polyphenol content increased significantly.

Eurotium cristatum;oat;extraction;fermentation condition;polyphenol content

TS201.3

0254-5071（2017）08-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.023

2017-05-09

國家自然科學(xué)基金（31571802）

王家琛（1996-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。