混合原料高濃度酒精發酵工藝優化

劉燕，劉鉞，柯濤*

（1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽473000；2.河南天冠企業集團有限公司試驗中心，河南南陽473000）

混合原料高濃度酒精發酵工藝優化

劉燕1，劉鉞2，柯濤1*

（1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽473000；2.河南天冠企業集團有限公司試驗中心，河南南陽473000）

在單因素試驗的基礎上，對混合原料高濃度酒精發酵工藝進行正交試驗優化，結果表明，影響高濃度酒精發酵因素的主次順序為發酵溫度＞糖化酶添加量＞發酵時間＞接種量＞搖床轉速，最佳發酵條件參數為發酵溫度33℃、糖化酶添加量160 U/g、發酵時間60 h、接種量25%、搖床轉速140 r/min。在此最佳工藝條件下，發酵醪酒精度可達到15.95%vol。

混合原料；高濃度；酒精；發酵；優化

當前用以支撐全球經濟發展的石油資源及能源供應正面臨嚴峻挑戰，且日益嚴重的環境污染使得人們越來越關注清潔環保的可再生能源。燃料乙醇作為一種新型清潔能源，是可再生能源中生物質能源開發利用的一個重要方向，仍有很大的發展空間[1-4]。伴隨著酒精發酵技術的不斷發展與創新，高濃度酒精發酵越來越受到行業的青睞。高濃度酒精發酵是以提高單位體積內發酵醪液中可溶性固形物的含量為目的，在耐高酒精度的釀酒酵母作用下，通過發酵條件的控制，力求得到最多的發酵終產物—乙醇[5]。高濃度酒精發酵法可減少能量消耗、提高設備利用率、降低生產成本、提高酒精年產量，是一種具有巨大應用價值的酒精發酵技術[6-7]。

目前，高濃度酒精發酵研究主要集中在高耐性釀酒酵母選育、發酵工藝優化、發酵模式改進、酶制劑添加應用及降低發酵醪液黏度等幾個方面[8-11]。高濃度酒精發酵仍然存在一些問題，如濃醪物料輸送、高糖及高濃度乙醇對酵母菌的抑制作用、發酵廢醪液如何分離等問題[12]。在發酵工藝優化方面，米慧芝等[13]采用釀酒酵母能直接發酵30%的蔗糖溶液，發酵周期只有2～3 d，其最終產生的酒精可以達到17.08%vol，對發展蔗糖酒精是個很好的契機。

微生物菌種是發酵工業的核心，在高濃度酒精發酵生產中，選育耐受高濃度、高酒精含量，高轉化率的優良菌株可以大幅提高發酵效率和企業的經濟效益。前期采用紫外誘變方法對原始菌株1308進行誘變，經過初篩、復篩及菌株遺傳穩定性試驗，得到菌株YB-18的發酵能力最強，故以菌株YB-18為試驗菌株開展混合原料高濃度酒精發酵優化研究。

本試驗結合天冠集團乙醇生產用原料使用情況，為提高原料利用率，優化發酵工藝，通過開展糖化酶添加量、發酵溫度、接種量、發酵時間及搖床轉速等單因素試驗，在此基礎上采用正交試驗探尋高濃度酒精發酵最佳工藝，以期為生產開展混合原料高濃度酒精發酵提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉∶玉米粉∶木薯粉（5∶3∶2）：天冠集團乙醇公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YB-18、1300、1308：天冠集團；安琪干酵母：安琪酵母股份有限公司；液化酶（30 000 U/m L）：江蘇省奧谷生物科技有限公司；糖化酶（100 000U/m L）：神舟生物科技有限公司；尿素：河南心連心化肥有限公司；葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為市售分析純。

一級種子培養基：濃度為14°Bx的麥芽汁，分裝于試管中，每支試管10m L，于121℃高壓滅菌器內滅菌30m in，冷卻備用。

二級種子培養基：拌料濃度為26%的液化醪，分裝于500m L三角瓶中，并于115℃高壓滅菌器內滅菌30min，冷卻備用。

發酵培養基：拌料濃度為34%的液化醪，分裝于1000m L三角瓶中，并于115℃高壓滅菌器內滅菌30m in，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

DK-S28電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY-211C恒溫培養振蕩箱：上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-6C生物顯微鏡：上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；DL-1萬用電爐：北京中興偉業儀器有限公司；SW-C-1C超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；PL-403電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

操作要點：

原料粉粹：將小麥、玉米、木薯經預處理后分別粉碎，小麥粉碎粒度為0.18mm，玉米粉碎粒度為1.50mm，木薯粉碎粒度為0.25mm。

拌料∶面粉∶玉米粉∶木薯粉（5∶3∶2），料水比為1∶1.95（g∶m L）。

液化：按試驗方案稱取原料，并用自來水調漿，攪拌均勻后用10%的硫酸或10%的氫氧化鈉調整pH值至5.4～5.6，繼續攪勻，按15U/g原料的比例加入α-淀粉酶，然后置于98℃恒溫水浴鍋內液化2 h，取出冷卻至室溫后補水至原質量。

種子培養：挑取1環試管斜面種子接入液體試管內，靜置于30℃培養箱內培養8h，然后將培養好的液體試管接種于搖瓶內，添加尿素（1 g/kg原料），于30℃、160 r/min的搖床上培養16 h，得到種子懸浮液。

糖化：采用邊糖化邊發酵工藝，糖化酶在接種時加入，添加量為160U/g原料。

酒精發酵：接種量25%，控制條件：0～8 h，32℃、150 r/min；8～24 h，34℃、135 r/m in；24 h后，33℃靜置發酵。發酵過程中定時對二氧化碳損失情況進行稱質量，當質量損失＜0.2 g/h時，結束酒精發酵。

1.3.2 發酵工藝優化單因素試驗

本試驗主要考察糖化酶添加量（100 U/g、120 U/g、140 U/g、160 U/g、180 U/g、200 U/g、220 U/g）；發酵溫度（31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃）；接種量（5%、10%、 15%、20%、25%、30%）；發酵時間（52 h、56 h、60 h、64 h、68 h）；搖床轉速（0、80 r/m in、100 r/m in、120 r/m in、140 r/m in、160 r/m in）等5個因素對菌株YB-18發酵的影響。

1.3.3 發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以糖化酶添加量（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）、發酵時間（D）、搖床轉速（E）為考察因素，以發酵終了醪液的酒精度為評價指標，進行L18（35）的正交優化試驗，確定最佳發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and leve ls of orthogonalexperiments for fermentation conditions optim ization

1.3.4 檢測方法

酒精度的測定：蒸餾-密度計法[15-16]；總糖的測定：斐林試劑滴定法[15-16]；外觀糖度的測定：密度計法[15-16]；酸度的測定：氫氧化鈉滴定法[15-16]；還原糖的測定：斐林試劑滴定法[15-16]。

2 結果與分析

2.1 高濃度條件下不同菌株酒精發酵性能比較

殘還原糖是檢驗可發酵糖是否完全利用的最準確的指標，是檢測酵母是否對糖“吃干榨凈”的指標[17]。殘總糖是酒精發酵后未被發酵而殘余的糖分，其含量高低是衡量酒精發酵完全程度的重要指標之一[18]。殘總糖越高，表示糖的利用率越低，反之糖的利用率越高。不同菌株在相同條件下進行酒精發酵時，殘還原糖及殘總糖越低，菌株的發酵能力越強。通過不同菌株發酵情況對比，選擇發酵能力強的菌株開展發酵工藝優化試驗。高濃度條件下不同菌株發酵性能比較結果見表2。

表2 高濃度酒精條件下不同菌株發酵結果Table 2 Fermentation results of different yeast strains under high concentration alcohol content conditions

由表2可知，菌株1308、1300及安琪干酵母的發酵性能相差不大，菌株YB-18發酵性能最強。菌株YB-18發酵終了時殘還原糖及殘總糖分別為0.28%、2.12%，明顯低于其他菌株；酒精度為15.65%vol，明顯高于其他菌株。菌株YB-18發酵終了醪液的外觀糖度、殘還原糖及殘總糖低，酒精度高。因此，選擇菌株YB-18為試驗菌株進行下一步試驗。

2.2 單因素試驗

2.2.1 糖化酶添加量對發酵的影響

隨著高濃度酒精發酵的快速發展，為了降低高糖的滲透作用，同步糖化（simultaneoussaccharifiction and fermentation，SSF）發酵模式被應用于高濃度酒精發酵[19]。不同糖化酶添加量對酒精發酵的影響，結果見圖1。

圖1 糖化酶添加量對發酵結果的影響Fig.1 Effectof glucoam ylase addition on fermentation results

由圖1可知，當糖化酶添加量＜160 U/g時，對發酵結果影響較大，殘總糖較高，酒精度明顯偏低，發酵不徹底。可能是因為糖化酶加入量過低，一方面淀粉及糊精不能完全水解，糖化不徹底，導致殘總糖較高；另一方面，較低的還原糖不能滿足酵母繁殖及代謝所需能量，酵母數量少且老化早，導致發酵不徹底。當糖化酶添加量為160U/g時，殘總糖達到最低值2.05%，酒精度達到最高值15.53%vol，再繼續增加糖化酶用量，各檢測指標變化很小。因此，最佳糖化酶添加量為160U/g。

2.2.2 發酵溫度對發酵的影響

不同的發酵溫度對酒精發酵的影響，結果見圖2。

圖2 發酵溫度對發酵結果的影響Fig.2 Effect o f ferm entation temperature on ferm entation resu lts

由圖2可知，發酵溫度的微小變化都會對菌株發酵能力產生影響。當發酵溫度由31℃提高至36℃時，發酵終了醪液的殘總糖先降低后升高，酒精度先升高后降低高。發酵溫度過高，酵母老化較快，發酵提前結束，發酵終了殘總糖較高，發酵不徹底。溫度的升高可以提高細胞生長速率，但過高的溫度卻阻礙了細胞的生長，從而影響了酒精的產量[20]。發酵溫度33℃時，殘總糖最低為2.08%，酒精度最高為15.55%vol。因此，最佳發酵溫度為33℃。

2.2.3 接種量對發酵的影響

適宜的接種量不僅有利于發酵的高效進行，還可以保證發酵的徹底。不同的接種量對酒精發酵的影響，結果見圖3。

圖3 接種量對發酵結果的影響Fig.3 Effect of inoculum on ferm entation results

由圖3可知，當接種量＜20%時，殘總糖較高，酒精度偏低，說明接種量過低，酵母數量不能在短時間內達到發酵要求的數量，導致發酵速率低，發酵不徹底。接種量為20%時，發酵終了殘總糖達到最低值2.02%，酒精度達到最高值15.60%vol。當接種量＞20%時，殘總糖開始升高，酒精度開始降低，說明接種量過高，酵母在短時間內繁殖數量多，容易老化，不利于發酵的進行。因此，最佳接種量為20%。

2.2.4 發酵時間對發酵的影響

不同的發酵時間對酒精發酵的影響，結果見圖4。

由圖4可知，當發酵時間由52 h延長至68 h時，發酵終了醪液的殘總糖逐漸降低，酒精度先升高后降低。當發酵時間達到60 h時，殘總糖較低為2.07%，酒精度達到最大值15.58%vol，繼續延長發酵時間，殘總糖基本不變，酒精度略有下降，原因可能是發酵時間過長，酒精會有少量揮發。因此，最佳發酵時間為60 h。

2.2.5 搖床轉速對發酵的影響

不同的搖床轉速對酒精發酵的影響，結果見圖5。

圖5 搖床轉速對發酵結果的影響Fig.5 Effect of shaker speed on fermentation results

由圖5可知，進行適當的搖動有利于發酵。當搖床轉速＜140 r/min時，攪拌不充分；當搖床轉速＞140 r/min時，不僅浪費能源，還可能攜帶溶解氧進到發酵瓶內，影響酵母厭氧發酵。隨著搖床轉速的提高（80～160 r/m in），殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸升高，說明發酵時進行搖動可以使料液混合均勻，便于糖化酶更好的發揮作用，后糖化效果較好，并且防止酵母菌沉淀，使其更好的進行酒精代謝。當搖床轉速達到140 r/m in時，殘總糖和酒精度基本不變。因此，最佳搖床轉速為140 r/m in。

2.3 正交試驗優化發酵工藝

在單因素試驗的基礎上，選用糖化酶添加量（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）、發酵時間（D）和搖床轉速（E）5個因素為評價因素，酒精度（Y）為評價指標進行L18（35）正交試驗，試驗結果及分析見表3，方差分析結果見表4。

由表3可知，影響高濃度酒精發酵因素的主次順序為B＞A＞D＞C＞E，即發酵溫度＞糖化酶添加量＞發酵時間＞接種量＞搖床轉速，最優組合為B2A2D2C3E3，即發酵溫度33℃、糖化酶添加量160U/g、發酵時間60 h、接種量25%、搖床轉速140 r/m in。在此優化條件下進行3次驗證試驗，結果表明發酵醪酒精度為15.95%vol。

由表4可知，糖化酶用量、發酵溫度及發酵時間對發酵結果影響顯著（P＜0.05），其余因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表3 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and ana lysis of orthogonalexperiments for fermentation conditions optim ization

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperiments results

3 結論

通過單因素試驗及正交試驗結果表明，影響混合原料高濃度酒精發酵因素的主次順序為發酵溫度＞糖化酶添加量＞發酵時間＞接種量＞搖床轉速，發酵最優水平組合為發酵溫度33℃、糖化酶添加量160 U/g、發酵時間60 h、接種量25%、搖床轉速為140 r/min，在此工藝條件下，殘總糖1.85%，酒精度15.95%vol，發酵徹底。

下一步將開展營養鹽及不同輔酶對混合原料高濃度酒精發酵的影響，進行50 L發酵罐的小型發酵試驗，進一步優化發酵工藝條件，為工業化生產提供參考。

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Optim ization ofhigh concentration alcohol fermentation processofm ixed raw materials

LIU Yan1,LIU Yue2,KETao1*
(1.SchoolofLife Science and Technology,Nanyang NormalUniversity,Nanyang 473000,China; 2.ExperimentCenter,Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

On thebasisof single factor experiments,the high concentration alcohol fermentation processofm ixed raw materialswasoptim ized by orthogonal experiments.The results showed that the factors affecting high concentration alcohol fermentation in orderwere fermentation temperature, glucoamylase addition,fermentation time,inoculum and shaker speed.The optimum fermentation conditionswere temperature 33℃,glucoamylase addition 160 U/g,time 60 h,inoculum 25%and shaker speed 140 r/min.Under the optimum conditions,the alcohol contentof fermentedmash was up to 15.95%vol.

m ixed raw materials;high concentration;alcohol;fermentation;optim ization

TS262.2；TS261.4

0254-5071（2017）08-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.018

2017-05-05

河南省重點科技攻關項目（152102310024）

劉燕（1984-），女，碩士研究生，研究方向為生物質能源。

*通訊作者：柯濤（1970-），女，副教授，博士，研究方向為生物制藥、生物能源與生物發酵。