高產Monacolin K紅曲霉菌株選育及發酵條件的優化

夏詩棋，管軼男，付正，鄒艷，李俊杰，管斌*，孔青

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島266101；3.山東醫學高等專科學校，山東濟南250002）

高產Monacolin K紅曲霉菌株選育及發酵條件的優化

夏詩棋1，管軼男2，付正3，鄒艷1，李俊杰1，管斌1*，孔青1

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島266101；3.山東醫學高等專科學校，山東濟南250002）

對產Monacolin K的紅曲霉菌株進行了復合誘變后的篩選和發酵條件優化。通過紫外-亞硝酸鈉復合誘變，得到一株高產Monacolin K的菌株3.991-7。通過單因素試驗，以Monacolin K的產量為指標，確定出最佳發酵條件：接種量7%，pH值為4.5，培養溫度為25℃，培養時間為10 d。在此最佳條件下，誘變菌株固態發酵后的Monacolin K的產量為9.06mg/g。

紅曲霉；莫納可林K；發酵條件；復合誘變

紅曲又稱丹曲，屬真菌門（Eumycophyta），紅曲科（Monascaceae），紅曲霉屬（Monascus）。紅曲的應用在我國有悠久的歷史，不僅被用于生產紅曲酒，而且在食醋、食品色素、中藥等制造方面有廣泛的應用[1]。近年來，紅曲逐漸被人們所重視，人們對其代謝產物的生產、應用、性質等方面進行了深入的研究，紅曲在生長過程中可以產生抑菌物質、色素、酶類、麥角固醇、桔霉素等多種代謝產物。

Monacolin K為白色針狀晶體，熔點為157～159℃，分子式為C24H36O5，分子質量為404，能夠溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮等有機溶劑，但不溶于石油醚和環己烷，其主要結構為氫化萘母核、β-羥-δ-內酯環和2-甲基-丁酸。Monacolin K是一種膽固醇合成抑制劑，是由日本學者Endo首次從紅色紅曲霉M.rubber van Tieghem中分離出的[2]。它能有效地抑制膽固醇生物合成過程中的關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA），并對該酶有較強的競爭性抑制作用，從而降低膽固醇的合成，尤其是酸式Monacolin K可以使肝臟避免受長期服用降血脂藥物等帶來的副作用[3-5]。日本、美國、加拿大等的學者在雞飼料中添加了0.25%的Monacolin K，可以使雞蛋中的膽固醇降低15%左右。Monacolin K還具有預防和治療膽結石、腫瘤和前列腺肥大的作用，是一種良好的次級代謝產物。

本研究通過篩選不同菌株、培養條件的優化和菌株誘變進行了提高紅曲霉產Monacolin K能力的研究，為Monacolin K的工業化生產提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

紅曲霉（Monascusanka）3.991：中國海洋大學食品科學與工程學院酶工程研究室保藏。

1.1.2 實驗原料

大米購買于青島市利群超市。

1.1.3 培養基

固體培養基：稱取20 g大米，蒸餾水洗凈至不渾濁，在蒸餾水中浸泡12 h后放入燒瓶中，調pH至6.0，121℃滅菌20m in。

斜面種子培養基：10°Bx麥芽汁瓊脂培養基，pH 6.0，121℃滅菌20min。

發酵培養基：蛋白胨0.8%，米粉8%，豆粕1%，NaNO30.3%，KH2PO40.15%，pH 6.0，121℃滅菌20m in。

1.1.4 試劑

Lovastatin標準品（超高純）：中國藥品生物制品檢定所；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；亞硝酸鈉、硝酸鈉（分析純）：淄博市臨淄天德精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

722N紫外分光光度計：上海精科儀器有限公司；HZQX100恒溫振蕩培養箱：東聯電子技術開發有限公司；XSP-9CA光學顯微鏡：上海光學儀器一廠；LD5-10B低速離心機：北京雷博爾離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

從實驗室保存的菌種斜面上挑取孢子于無菌水中，進行10倍梯度稀釋，然后選取合適稀釋倍數的菌懸液，涂布麥芽汁培養基，在30℃恒溫培養箱中培養7 d，在培養過程中選取生長速度快、顏色紅的菌落進行斜面保存。

1.3.2 紫外線對紅曲霉的誘變處理

取濃度為103～104個/m L的孢子懸浮液10m L，加入無菌培養皿中，在磁力攪拌下置于15W紫外燈前15 cm處進行照射[6]，分別照射0、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s和120s，取出100μL孢子懸浮液，冰浴15min，分別取0.2m L涂布至Lovastatin抗性平板上，每組兩個平行，30℃避光培養10 d，觀察并記錄菌落數，計算致死率，其計算公式如下：

式中：A為對照組菌落數；B為誘變組菌落數。

1.3.3 紫外-亞硝酸鈉對紅曲霉的復合誘變處理

分別取0.05mol/L亞硝酸鈉溶液1m L，加入到50m L三角瓶中，再分別加入1m L上述紫外誘變后的孢子懸浮液，立即加lm L pH4.5醋酸緩沖液，分別誘變0、30 s、60 s、90 s、120s、150s、180s和210s后，加入pH 8.6的Na2HPO4（0.07mol/L）2m L終止反應；然后，分別取0.2m L涂布至抗性平板上，兩個平行，30℃培養10 d，觀察菌落數，計算致死率。

1.3.4 Monacolin K高產菌株的篩選

先采用Lovastatin抗性平板初篩。在平板培養基中加入一定濃度的Lovastatin溶液0.5m L，使平板培養基中Lovastatin質量濃度分別為100μg/m L、200μg/m L、300μg/m L、400μg/m L、500μg/m L、600μg/m L、700μg/m L和800μg/m L，每個濃度平行兩個平板，待平板冷卻凝固后，加入已制備的適當稀釋后的孢子懸浮液（濃度為103～104個）0.2m L進行涂布，30培養7 d后，觀察菌體生長情況并進行紀錄，未有紅曲霉菌株生長的最低Lovastatin濃度為最低紅曲霉抑制濃度。按照最低紅曲霉抑制濃度配制成的Lovastatin平板即為Lovastatin抗性平板，再將復合誘變后的孢子懸浮液用生理鹽水適當稀釋，取0.2m L涂布于Lovastatin抗性平板上，30℃培養7 d。觀察菌落生長狀況，挑取生長狀況良好的菌落進行斜面保藏。

對初篩得到的菌株進行固體培養基發酵復篩。將初篩所得的10株菌進行種子培養，然后轉接至發酵培養，每株3個平行。測定其Monacolin K的產量，并記錄。

1.3.5 誘變菌株遺傳穩定性實驗

取復篩后Monacolin K產量較高的3株誘變菌株進行斜面保藏，然后按照上述發酵培養方法進行重復性發酵實驗，連續傳代4次，通過1.3.8中的方法檢測發酵液的Monacolin K產量，以未突變菌株Monacolin K的產量作為對照。

1.3.6 培養條件的優化

以發酵培養基中的Monacolin K產量為評價指標進行單因素實驗，因素水平設計為：在發酵溫度30℃、發酵時間200 h、發酵培養基初始pH值為6的條件下，接種量設為5%、6%、7%、8%、9%、10%；在接種量為7%，發酵溫度為30℃，發酵培養基初始pH值為6的條件下，發酵時間設為140 h、160 h、180 h、200 h、220 h、240 h、260 h和280 h；在接種量為7%，發酵時間為240 h，發酵培養基初始pH為6的條件下，發酵溫度設為20℃、25℃、30℃和35℃；在接種量為7%，發酵時間為240 h，發酵溫度為25℃的條件下，發酵培養基的初始pH設為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。分別研究在上述不同發酵條件對紅曲霉菌種產Monacolin K的影響。

1.3.7 誘變菌株固態發酵分析

將紫外-亞硝酸鈉復合誘變得到的菌株和未誘變的菌株在優化后的培養基上進行固態發酵，測定MonacolinK產量。

1.3.8 Monacolin K含量的測定

Monacolin K含量采用中華人民共和國輕工行業標準QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》中的高效液相色譜方法進行測定[7]。

2 結果與分析

2.1 菌株的誘變處理

2.1.1 紫外線對紅曲酶的誘變處理

圖1 紫外誘變時間對紅曲霉致死率的影響Fig.1 Effectof ultravioletmutation time on the lethality of Monascus anka

對紅曲霉3.991進行紫外誘變，釆用致死率來考察紫外線對紅曲霉的損傷作用。為獲得較高的正突變率，方便誘變菌株的篩選，選擇致死率為70%～80%的致死率為最佳。如圖1所示，當紫外誘變時間為30 s時，紅曲霉致死率到達78%，因此選擇30 s為最佳誘變時間。

2.1.2 紫外-亞硝酸鈉對紅曲霉的復合誘變處理

對紅曲霉3.991進行紫外-亞硝酸鈉復合誘變，以誘變致死率來考察紫外-亞硝酸鈉對紅曲霉3.991損傷作用，紫外-亞硝酸鈉復合誘變時間對紅曲霉3.991致死率的影響結果見圖2。為獲得較高概率的紅曲霉突變菌株，選擇較高的致死率，由圖2可知，當亞硝酸鈉誘變時間達到150 s時，致死率達到90.8%，之后再繼續延長誘變時間，致死率保持平穩，因此選擇亞硝酸鈉誘變時間選為150 s作為最佳誘變時間。

圖2 紫外-亞硝酸鈉復合誘變時間對紅曲霉致死率的影響Fig.2 Effect o f UV-sodium nitrite com pound m utagenesis time on the lethality of Monascus anka

2.2 Monacolin K高產菌株的篩選

2.2.1 Lovastatin質量濃度的確定

圖3 Lovastatin質量濃度對紅曲霉生長的影響Fig.3 Effect of Lovastatin concentration on the grow th of Monascus anka

選擇Lovastatin抗性平板對誘變菌株進行篩選的方法，可以在誘變后篩選出相對正突變率較高的菌株，主要是因為Monacolin K產量較高的菌株的Lovastatin抗性必然較高，反之，若誘變后的紅曲菌株無法在Lovastatin抗性平板成活，則說明其Monacolin K產率較低而被淘汰。但抗性平板的篩選會導致誘變菌株的致死率增加，所以注意選擇適宜的誘變劑量和Lovastatin抗性平板濃度較為重要[8]，Lovastatin對紅曲霉生長的影響見圖3。

由圖3可知，Lovastatin對紅曲霉的生長有明顯的抑制作用，平板中紅曲菌的菌落數隨培養基中的Lovastatin的質量濃度的升高而逐漸減少，當Lovastatin的質量濃度達到600μg/m L時，未見有菌落生長，確定Lovastatin的質量濃度600μg/m L為最低抑菌濃度。

2.2.2 復合誘變復篩結果

根據紫外-亞硝酸鈉復合誘變，將初篩選出的10株菌（3.991-1～3.991-10）進行固態發酵，用HPLC測定其Monacolin K產量，結果如表1所示。由表1可知，菌株3.991-2、3.991-7和3.991-8的Monacolin K的產量較高，因此，選定這3株菌進行遺傳穩定性實驗。

表1 10株紅曲霉的Monacolin K含量Table 1 Monacolin K contents of ten strains of Monascus anka

2.2.3 遺傳穩定性實驗

圖4 誘變菌株的遺傳穩定性Fig.4 Genetic stability ofmutant strains

對紫外-亞硝酸鈉復合誘變得到的3株產Monacolin K含量較高的菌株3.991-2、3.991-7和3.991-8進行遺傳穩定性實驗，傳代4次，測量其Monacolin K的產量，結果如圖4所示。由圖4可知，3株誘變菌株的遺傳穩定性都較為良好，菌株3.991-2的Monacolin K產量最低，且從第二代開始Monacolin K產量緩慢下降；菌株3.991-7的穩定性最高，傳代5次之后，其Monacolin K產量依舊最高，而且沒有顯著降低；菌株3.991-8的Monacolin K產量較高，但是在傳代2次之后其Monacolin K產量呈現出下降的趨勢，表明菌株3.991-8的遺傳穩定性較差，當傳代次數過多后會導致Monacolin K的產量降低。綜上所述，選擇菌株3.991-7作為高產MonacolinK的紅曲霉誘變菌種。

2.3 培養條件的優化

2.3.1 接種量對Monacolin K產量的影響

接種量作為影響紅曲霉生長的重要因素[9-10]，其大小決定了紅曲霉在發酵過程中的生長繁殖速度，采用較大的接種量可以縮短發酵中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，但接種量過大會引起溶氧不足，營養物質消耗較快，影響產物的合成，因此，對Monacolin K的產量有直接的影響。本實驗分別研究了接種量為5%，6%，7%，8%，9%和10%時對Monacolin K產量的影響，結果見圖5。

圖5 接種量對Monacolin K產量的影響Fig.5 Effect of inoculum on Monacolin K yield

由圖5可知，隨著接種量的增加，Monacolin K的產量呈現先上升后下降的趨勢，當接種量為7%時，Monacolin K的產量達到最大值，為8.76mg/g，因此最適接種量為7%。

2.3.2 發酵時間對Monacolin K產量的影響

圖6 發酵時間對Monacolin K產量的影響Fig.6 Effect of fermentation tim e on Monacolin K yie ld

發酵時間直接影響紅曲霉的生長和Monacolin K的產生[11]，發酵時間對Monacolin K產量的影響如圖6所示。

由圖6可知，剛開始發酵時間與Monacolin K的含量成正比，發酵時間越長，Monacolin K的含量越多；但當到達一定時間之后，Monacolin K的含量就處于穩定狀態，因此，確定發酵時間對于Monacolin K的產量也至關重要。在240 h之前，紅曲米的色調隨著發酵時間的增長而增大，但當發酵時間達到240 h后，紅曲米的色調增加緩慢，因此，從經濟角度考慮，選擇240 h（10 d）為最佳發酵時間。

2.3.3 發酵溫度對Monacolin K產量的影響

溫度對菌體生長及產物的合成方面具有重要的影響，這是因為所有的酶受溫度的影響較大，只有酶的活性較高時才能保證菌體處于活性較高的狀態，而且溫度對發酵的影響是很復雜的，主要表現在對細胞生長繁殖代謝、產物的合成等方面[12]。發酵溫度對Monacolin K產量的影響如圖7所示。

圖7 發酵溫度對Monaco lin K產量的影響Fig.7 Effect o f fermentation temperature on Monaco lin K yield

由圖7可知，發酵溫度對Monacolin K的產量有較大的影響，隨著發酵溫度的增加，Monacolin K的產量也增大，當發酵溫度為25℃時，色調達到最大值，即Monacolin K的產量最大。隨著溫度的進一步升高，Monacolin K的產量降低，因此，最合適紅曲霉產Monacolin K的溫度為25℃。

2.3.4 不同pH值對Monacolin K產量的影響

圖8 不同pH值對Monacolin K產量的影響Fig.8 Effects of different pH value on Monacolin K yield

pH是影響紅曲霉生長的關鍵因素，且紅曲霉是腐生真菌、嗜酸，研究培養基中最適合紅曲霉生長的pH值對Monacolin K的產量具有重要作用[13]。不同pH對Monacolin K產量的影響如圖8所示。

由圖8可知，pH值為7.0時，Monacolin K的產量最低，表明紅曲霉適合在酸性環境下生長。隨著pH值的增加，Monacolin K的產量先增大后降低，并且在pH值為4.5時達到最大值，達到8.92mg/g，因此，適合菌體生長且Monacolin K產量最高的pH值為4.5。

2.4 誘變菌株固態發酵分析

將紫外-亞硝酸鈉復合誘變菌株3.991-7在優化好的培養基上進行固態發酵后測量其Monacolin K的產量結果見表2。由表2可知，在優化后的培養基上，誘變菌株與未誘變菌株相比其Monacolin K產量有了很大的提高，是原來的8.9倍。

表2 誘變菌株與未誘變菌株的Monacolin K產量Table 2 Monacolin K contents ofmutant and non-mutant strains

3 結論

對實驗室保存的紅曲霉菌株3.991進行紫外-亞硝酸鈉復合誘變，通過Lovastatin平板初篩以及搖瓶發酵復篩，篩選得到了1株高產Monacolin K的紅曲霉菌株3.991-7，固態發酵后的Monacolin K的產量為8.06mg/g，與未誘變的菌株（1.02mg/g）相比，Monacolin K含量是原來的8.9倍，而目前報道的固態發酵紅曲米中的Monacolin K的含量在1.78～2.18mg/g[14-15]。

以大米為原料，接種紅曲霉菌株3.991-7進行固態發酵，以Monacolin K的產量為評價指標，通過單因素實驗確定最佳培養條件為接種量7%，pH值為4.5，培養溫度為25℃，培養時間為10 d，在此條件下測得的Monacolin K產量最高，達到了9.06mg/g。

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Screening and fermentation conditions of Monascus anka with high yield of Monacolin K

XIA Shiqi1,GUAN Yinan2,FU Zheng3,ZOU Yan1,LIJunjie1,GUAN Bin1*,KONGQing1
(1.College ofFood Science and Engineering,Ocean University ofChina,Qingdao 266003,China; 2.Qingdao V land Biotech Inc.,Qingdao 266101,China;3.Shandong MedicalCollege,Jinan 250002,China)

M onascus anka w ith Monacolin K yield was screened by compound mutagenesis,and the fermentation conditionswas optim ized.By UV and sodium nitrite compound mutation,a strain 3.991-7 w ith high yield Monacolin K was obtained.Using Monacolin K yield as index,the optimal fermentation conditionswere optimized by single factor experimentsas follows:inoculum 7%,pH 4.5,culture temperature 25℃,time 10 d.Under the conditions,theMonacolin K yield ofmutantstrainwas9.06mg/gw ith solid-state fermentation.

M onascusanka;Monacolin K;fermentation conditions;compoundmutation

TQ925

0254-5071（2017）08-0062-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.014

2017-03-07

“十二五”農村領域國家科技計劃（013BAD10B02-06）；山東省科技計劃項目（2014GSF121029）

夏詩棋（1992-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：管斌（1957-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程。