莪術(shù)單煎及與三棱合煎后揮發(fā)油中有效成分煎出率的比較研究Δ

李文靜，崔 濤，蔡德富，樊 麗，張 昊，劉 雷，洪 博（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

莪術(shù)單煎及與三棱合煎后揮發(fā)油中有效成分煎出率的比較研究Δ

李文靜＊，崔 濤，蔡德富，樊 麗，張 昊，劉 雷，洪 博#（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006）

目的：研究莪術(shù)與三棱配伍前后莪術(shù)揮發(fā)油中4種有效成分的煎出率變化，為揭示莪術(shù)與三棱配伍的作用機(jī)制提供參考。方法：采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定莪術(shù)單煎及與三棱合煎后揮發(fā)油中4種有效成分（莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯）的含量，并對(duì)各成分的煎出率進(jìn)行比較。結(jié)果：與莪術(shù)單煎比較，合煎后揮發(fā)油中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮的煎出量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），β-欖香烯的煎出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：莪術(shù)與三棱配伍合煎后可有效增加其揮發(fā)油中有效成分莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮的溶出，推測(cè)此可能為二者配伍后藥效增強(qiáng)的原因。

莪術(shù)；三棱；合煎；配伍；高效液相色譜法；煎出率

血瘀是腫瘤發(fā)病的重要病因、病理機(jī)制或結(jié)果，活血化瘀類抗腫瘤藥具有改善血液循環(huán)、提高機(jī)體自身抗病能力、延長腫瘤患者生存期等作用[1-2]。莪術(shù)、三棱配伍用藥出自《經(jīng)驗(yàn)良方》，為中藥配伍用于治療血瘀證頻率較高的一個(gè)藥對(duì)[3-5]，具有氣血兼顧、活血祛瘀、行氣止痛、療效增強(qiáng)的作用[6-7]。但其配伍增效的機(jī)制目前尚未明了，需要進(jìn)一步研究。考慮到兩藥均有行氣破血之功效，合用后療效加強(qiáng)，筆者假設(shè)是因?yàn)槠渲兄饕挠行С煞趾堪l(fā)生了變化所致。基于此，設(shè)計(jì)了比較莪術(shù)、三棱配伍前后主要成分含量變化的相關(guān)研究。由于莪術(shù)的主要成分為揮發(fā)油，其占主要成分含量的1%～2.5%[8-9]；揮發(fā)油中主要成分為單萜和倍半萜類，如莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯等，這些成分均為莪術(shù)活血化瘀、抗菌、抗腫瘤作用的主要活性物質(zhì)[10-14]。因此，本試驗(yàn)以莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯為考察指標(biāo)，考察莪術(shù)、三棱配伍前后這4個(gè)主要活性成分的含量變化，以期分析莪術(shù)、三棱的配伍作用機(jī)制，為二者臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4個(gè)有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 莪術(shù)中4個(gè)有效成分的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of 4 active ingredients in C.phaeocaulis

1 材料

1.1 儀器

LC-1000D高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等（山東魯能瑞虹化工儀器有限公司）；TC-C18色譜柱（美國Agilent公司）；BS124S電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB-3200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

莪術(shù)（批號(hào)：20150329）、三棱（批號(hào)：20151104）均購自亳州市國峰藥業(yè)銷售有限公司，產(chǎn)地為安徽亳州，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥研究室郭麗娜教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)（Curcuma phaeocaulis Val.）的干燥根莖和黑三棱科植物黑三棱或細(xì)葉黑三棱（Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.）的塊莖；莪術(shù)二酮對(duì)照品（批號(hào)：111800-201001，純度：99.2%）、莪術(shù)醇對(duì)照品（批號(hào)：100185-200506，純度：99.5%）、吉馬酮對(duì)照品（批號(hào)：111665-201204，純度：99.8%）、β-欖香烯對(duì)照品（批號(hào)：100268-200401，純度：99.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 合煎揮發(fā)油樣品溶液的制備 本課題組前期已經(jīng)做了莪術(shù)配伍三棱提取物的藥效學(xué)研究，所以本試驗(yàn)采用前期的樣品制備方法。取莪術(shù)、三棱粉碎，過20目篩，各取20 g置于1 000 mL燒瓶中，加入600 mL水，加熱回流4 h；采用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油。將提取的揮發(fā)油收集至5 mL量瓶中，加入甲醇超聲（功率：250 W，頻率：25 kHz）30 min、溶解并定容，得樣品母液。取100 μL母液置于10 mL量瓶中加甲醇定容，即將母液稀釋100倍得待測(cè)樣品溶液。

2.1.2 單煎揮發(fā)油樣品溶液的制備 稱取莪術(shù)粉末20 g，依照上法提取單味藥材的揮發(fā)油，制備成一定體積溶液，待測(cè)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)40℃減壓干燥后的莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯對(duì)照品適量，分別加入甲醇溶解、稀釋，制備成莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯質(zhì)量濃度分別為1.28、0.53、0.68、2.694 mg/mL的4種對(duì)照品溶液及其混合溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）溶液梯度洗脫（洗脫程序如下：0～15 min，80%A；15～20 min，80%～100%A；20～25 min，100%～80%A），每次進(jìn)樣間隔用80%乙腈平衡；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：216 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 專屬性考察

分別吸取各對(duì)照品溶液及對(duì)照品混合溶液、樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果4個(gè)活性成分出峰位置處未見干擾，表明本條件下專屬性良好，色譜圖詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品混合溶液，逐級(jí)稀釋，制備成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的稀釋溶液，進(jìn)樣10 μL（各溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，取峰面積平均值）。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：莪術(shù)二酮y＝6.0×106x+2.5×104（r＝0.999 8）、莪術(shù)醇y＝1.0×106x+ 309.9（r＝0.999 7）、吉馬酮y＝1.0×107x+1.713×104（r＝0.999 9）、β-欖香烯y＝9.64×105x+7.766×104（r＝0.998 7）。結(jié)果表明，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.04～1.28、0.017～0.530、0.021～0.680、0.084～2.694 mg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯峰面積的RSD分別為1.3%、1.9%、1.8%、0.57%（n＝6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取合煎揮發(fā)油樣品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯峰面積的RSD分別為2.2%、1.1%、2.4%、3.2%（n＝6），表明樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備莪術(shù)、三棱合煎揮發(fā)油樣品溶液6份，進(jìn)樣、測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯峰面積的RSD分別為2.9%、2.1%、3.1%、4.3%（n＝6）。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的莪術(shù)、三棱合煎揮發(fā)油樣品溶液6份，每份500 μL，分別加入相等量的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣、測(cè)定并計(jì)算待測(cè)成分的平均加樣回收率。結(jié)果，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β-欖香烯的平均回收率分別為98.22%（RSD＝2.1%，n＝6）、96.89%（RSD＝1.2%，n＝6）、99.78%（RSD＝1.8%，n＝6）、97.34%（RSD＝2.2%，n＝6）。

2.10 樣品測(cè)定

取莪術(shù)單煎及與三棱合煎后揮發(fā)油樣品溶液，平行制備3份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量并計(jì)算煎出率（提取液中有效成分的質(zhì)量/總藥材質(zhì)量×100%），結(jié)果見表1。

表1 莪術(shù)單煎及與三棱合煎后有效成分煎出率（n＝3，%%）Tab 1 Decoction rate of active ingredients in C.phaeocaulis single decoction and combined decoction mixedly with S.stoloniferum（n＝3，%%）

表1結(jié)果表明，合煎后莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮的煎出率明顯高于單煎，而β-欖香烯的煎出率差別不大。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果與合煎比較，單煎后莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮煎出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），β-欖香烯的煎出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

中藥藥對(duì)發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是方中的化學(xué)成分，對(duì)藥對(duì)進(jìn)行化學(xué)成分的研究，有助于闡明中醫(yī)方劑理論，揭示中藥配伍規(guī)律和作用機(jī)制。中藥復(fù)方的作用基礎(chǔ)從化學(xué)成分上分析，可能存在同一中藥共存成分之間及與配伍中藥成分之間的復(fù)合作用，這些有效成分可共同發(fā)揮復(fù)合及協(xié)同作用，治療及改善多種癥狀。因此，加強(qiáng)中藥復(fù)方化學(xué)成分研究，在開發(fā)研制創(chuàng)新藥物上有重要意義。

筆者在本試驗(yàn)中以莪術(shù)、三棱藥對(duì)為研究對(duì)象，首先建立了乙腈-水梯度洗脫同時(shí)檢測(cè)莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯4種成分含量的方法。采用該方法時(shí)，上述4個(gè)成分均可在20 min內(nèi)完成檢測(cè)，方法學(xué)考察結(jié)果也顯示方法準(zhǔn)確、可靠，可用于測(cè)定藥材中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和β-欖香烯的含量。之后的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)單煎及其與三棱合煎后揮發(fā)油中莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮的煎出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并據(jù)此推測(cè)兩藥合煎有助于這3種主要有效成分的溶出，從而導(dǎo)致3種有效成分含量的增加。后續(xù)工作擬通過化學(xué)成分分離研究與圖譜研究來進(jìn)一步揭示莪術(shù)與三棱的配伍作用機(jī)制，為二者配伍提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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Comparative Study on Decoction Rates of Active Ingredients in Volatile Oil after Curcuma phaeocaulis Single Decoction and Combined Decoction with Sparganium stoloniferum

LI Wenjing，CUI Tao，CAI Defu，F(xiàn)AN Li，ZHANG Hao，LIU Lei，HONG Bo（School of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

OBJECTIVE：To study the decoction rate changes of 4 active ingredients in the volatile oil of Curcuma phaeocaulis before and after combined with Sparganium stoloniferum，and provide reference for showing the compatibility mechanism of C.phaeocaulis and S.stoloniferum.METHODS：HPLC was used to simultaneously determine the contents of 4 active ingredients（curdione，curcumol，germacrone and β-elemene）in the volatile oil of C.phaeocaulis after C.phaeocaulis single decoction and combined decoction with S.stoloniferum.And the fried rates of each ingredient were compared.RESULTS：Compared with C.phaeocaulis single decoction，there was significant difference in the fried amounts of curdione，curcumol，germacrone in the volatile oil after combined decoction（P＜0.05）and no significant difference in fried rate of β-elemene（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The combined decoction of C.phaeocaulis and S.stoloniferum can effectively improve the dissolution of curdione，curcumol，germacrone in the volatile oil.It may be the reason for the enhancement of efficacy after compatibility.

Curcuma phaeocaulis；Sparganium stoloniferum；Combined decoction；Compatibility；HPLC；Fried rate

R283

A

1001-0408（2017）22-3110-03

2016-11-21

2017-01-13）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81403173）

＊講師，博士。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0452-2663159。E-mail：lwj022325@163.com

#通信作者：講師，博士。研究方向：中藥配伍機(jī)制。電話：0452-2663159。E-mail：bohong200630174@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.23

術(shù)對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].山東醫(yī)藥，2012，52（4）：51-55.

Comparative Study on Decoction Rates of Active Ingredients in Volatile Oil after Curcuma phaeocaulis Single Decoction and Combined Decoction with Sparganium stoloniferum

LI Wenjing，CUI Tao，CAI Defu，F(xiàn)AN Li，ZHANG Hao，LIU Lei，HONG Bo（School of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

OBJECTIVE：To study the decoction rate changes of 4 active ingredients in the volatile oil of Curcuma phaeocaulis before and after combined with Sparganium stoloniferum，and provide reference for showing the compatibility mechanism of C.phaeocaulis and S.stoloniferum.METHODS：HPLC was used to simultaneously determine the contents of 4 active ingredients（curdione，curcumol，germacrone and β-elemene）in the volatile oil of C.phaeocaulis after C.phaeocaulis single decoction and combined decoction with S.stoloniferum.And the fried rates of each ingredient were compared.RESULTS：Compared with C.phaeocaulis single decoction，there was significant difference in the fried amounts of curdione，curcumol，germacrone in the volatile oil after combined decoction（P＜0.05）and no significant difference in fried rate of β-elemene（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The combined decoction of C.phaeocaulis and S.stoloniferum can effectively improve the dissolution of curdione，curcumol，germacrone in the volatile oil.It may be the reason for the enhancement of efficacy after compatibility.

Curcuma phaeocaulis；Sparganium stoloniferum；Combined decoction；Compatibility；HPLC；Fried rate

R283

A

1001-0408（2017）22-3110-03

2016-11-21

2017-01-13）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81403173）

＊講師，博士。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0452-2663159。E-mail：lwj022325@163.com

#通信作者：講師，博士。研究方向：中藥配伍機(jī)制。電話：0452-2663159。E-mail：bohong200630174@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.23