半夏瀉心湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TLRs/NF-κB通路相關因子表達的影響

趙增強（南陽醫學高等?？茖W校中醫系，河南南陽 473061）

半夏瀉心湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TLRs/NF-κB通路相關因子表達的影響

趙增強＊（南陽醫學高等?？茖W校中醫系，河南南陽 473061）

目的：觀察半夏瀉心湯對潰瘍性結腸炎（UC）大鼠結腸組織中核轉錄因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）及Toll樣受體4（TLR4）表達的影響，探討其治療UC的可能機制。方法：將大鼠隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、柳氮磺吡啶腸溶片（SASP，陽性對照，0.3 g/kg）和半夏瀉心湯低、中、高劑量組（3.9、7.8、11.7 g/kg），每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均采用三硝基苯磺酸-乙醇法復制UC模型。成模后，ig給藥，每天1次，連續3周。給藥結束后，檢測各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白的表達。結果：與正常組比較，其余各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；半夏瀉心湯具有一定的劑量依賴性，且高劑量組大鼠結腸組織中上述水平的降低程度均高于SASP組（P＜0.05）。結論：半夏瀉心湯可下調UC大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α及TLR4 mRNA及蛋白的表達，這可能是其治療UC的作用機制之一。

半夏瀉心湯；潰瘍性結腸炎；核轉錄因子κB p65；NF-κB抑制蛋白α；Toll樣受體4

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種病因尚未被完全闡明的慢性腸道非特異性結腸炎癥，病變位于直腸、結腸及結腸黏膜下層，臨床主要表現為腹瀉、腹痛及黏液膿血便等。UC多發于30～40歲年齡段，該病治療難度大、易反復發作，是世界衛生組織公認的難治性疾病[1]。目前，UC的治療仍以柳氮磺吡啶、糖皮質激素、免疫抑制劑等化學藥為主，但化學藥長期使用的毒副作用較大，且患者的病情遷延不愈，導致出現較多停藥現象[2]。傳統中醫藥講究論本而治，在治療UC中具有明顯優勢，烏梅丸、半夏瀉心湯、泄濁解毒方等在UC治療中均取得了理想的療效[3]。

半夏瀉心湯出自東漢張仲景《傷寒論》，由半夏、黃芩、黃連、炙甘草、干姜、人參、大棗等7味中藥材組成，具有寒熱平調、調和肝脾、消痞散結的功效，是辛開苦降、調和脾胃陰陽的代表方劑，最初為治療心下痞癥所設，后多用于消化道類疾病的治療[4]。目前，針對半夏瀉心湯治療UC的研究多停留在初步藥效研究階段，對相關機制研究的報道相對較少。近年來，國內外均有研究認為與免疫調控相關的細胞通路——Toll樣受體（TLRs）/核轉錄因子κB（NF-κB）在UC發病中占重要地位[5]。本研究以三硝基苯磺酸-乙醇誘導大鼠UC模型，觀察半夏瀉心湯對大鼠結腸組織中TLRs/NF-κB通路相關因子[NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκB-α）和TLR4]的影響，旨在闡明半夏瀉心湯治療UC的可能機制。

1 材料

1.1 儀器

Mastercycler Nexus聚合酶鏈式反應（PCR）儀[艾本德（上海）國際貿易有限公司]；ABI7500熒光定量檢測儀（美國應用生物系統公司）；全自動凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

方中半夏、黃連、人參、干姜、黃芩、炙甘草、大棗等藥材購自河南中醫藥大學附屬醫院，經河南中醫學院王憲齡教授鑒定均為真品；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP，上海中西三維制藥有限公司，批號：20091130，規格：250 mg/片）；三硝基苯磺酸（美國Sigma公司，純度：99.99%）；鼠抗NF-κB p65抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）、IκB-α、TLR4抗體及兔抗鼠免疫球蛋白M（IgM）二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；Trizol RNA提取劑（美國Invitrogen公司）；cDNA逆轉錄試劑盒（德國Qiagen公司）；熒光定量PCR檢測試劑盒（日本Takara公司）。

1.3 動物

SD大鼠50只，SPF級，♂，體質量180～220 g，購自河南省實驗動物中心[許可證號：SCXK（豫）2005-0001]。所有大鼠均于溫度為22℃、相對濕度為60%的環境中飼養，期間自由飲水、按量飲食，適應性飼養3 d后開始實驗。

2 方法

2.1 半夏瀉心湯的制備

原著《傷寒論》中半夏瀉心湯的組成為半夏12 g，黃連3 g，人參、干姜、黃芩、炙甘草各9 g，大棗9 g。按照原著中生藥比例，根據《方劑學》所載用量進行折算后，取半夏60 g，黃連15 g，人參、干姜、黃芩、炙甘草、大棗各45 g，將上述各藥放入砂鍋中并加入400 mL水浸泡40 min，然后以武火煎煮至水開，再用文火煎煮30 min，取水煎液；藥渣再加入400 mL水按照上述方法煎煮；合并2次水煎液，過濾；最后“去渣再煎”濃縮成生藥量為1 g/mL的湯劑，貯存于冰箱中，備用。

2.2 造模、分組與給藥

隨機抽取8只大鼠作為正常組，其余大鼠進行造模。在造模前大鼠禁食不禁水24 h，然后乙醚麻醉，固定大鼠四肢呈仰臥位，使用2 mm的硅膠管沿肛門推注用30%乙醇溶液制備的三硝基苯磺酸溶液（100 mg/kg），停留15 min后拔出。大鼠清醒后自由飲食。造模3 d后隨機抽取2只大鼠檢查造模情況，若結腸有充血、典型潰瘍變化即為造模成功。造模成功后，將剩余40只大鼠隨機分為5組，分別為模型組、SASP組和半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組8只。造模后第4天開始給藥，正常組和模型組大鼠ig生理鹽水10 mL/kg；SASP組大鼠ig以蒸餾水配制的柳氮磺吡啶溶液0.3 g/kg（為人臨床用量的10倍劑量）；半夏瀉心湯低、中、高劑量組大鼠分別ig“2.1”項下湯劑3.9、7.8、11.7 g/kg（分別根據人臨床用量的2.5、5、10倍換算而得），每日1次，連續3周。給藥期間大鼠正常喂食，并觀察各組大鼠的精神狀態、飲食狀況等一般情況。

2.3 標本采集

大鼠末次給藥后禁食12 h，ip戊巴比妥鈉溶液（60 mg/kg）麻醉，將四肢固定在解剖臺上，沿腸系膜剪開，取結腸組織中間段5～8 cm，預冷生理鹽水沖洗組織。將部分組織快速置于－80℃冰箱中凍存備用，另一部分直接進行總RNA提取。

2.4 RT-PCR法檢測大鼠結腸組織中TLR4、NF-κB p65、IκB-α mRNA表達

采用Trizol法提取結腸組織中總RNA。通過Reverse Transcription Kit將RNA逆轉錄為cDNA，然后根據SYBRPremix EX Taq試劑盒操作進行qRT-PCR反應。反應體系總體積：25 μL。PCR擴增程序：95℃、30 s；95℃、5 s，55℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2－ΔΔct法計算mRNA相對表達量。基因的引物序列及產物大小見表1。

表1 基因的引物序列及產物大小Tab 1 Primer sequence and product size of genes

2.5 Western blot法檢測大鼠結腸組織中TLR4、NF-κB p65、IκB-α蛋白表達

采用強RIPA蛋白裂解法提取大鼠結腸組織中總蛋白，冰上裂解45 min，裂解期間間隔混勻組織液，裂解完成后于4℃條件下14 000×g離心15 min，收集上清液。采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，并將各組濃度調至一致后，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（10%分離膠和5%濃縮膠）。采用電轉法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入預先按照說明書稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入兔抗鼠IgM二抗，室溫下孵育2 h。洗膜并采用增強化學發光法顯色，采用全自動凝膠成像儀采集圖片，并使用Image J軟件進行條帶分析。以目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD法，方差非齊性時采用Dunnett’s T3法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 半夏瀉心湯對UC大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達的影響

與正常組比較，其余各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），且半夏瀉心湯的作用具有一定的量效關系；其中半夏瀉心湯高劑量組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達水平及半夏瀉心湯中劑量組大鼠結腸組織中IκB-α mRNA表達水平均顯著低于SASP組（P＜0.05），結果見表2。

3.2 半夏瀉心湯對UC大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達的影響

與正常組比較，其余各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且半夏瀉心湯的作用具有一定的量效關系；其中半夏瀉心湯各劑量組大鼠結腸組織中NF-κB p65蛋白表達水平和高劑量組TLR4蛋白表達水平以及中劑量組IκB-α蛋白表達水平均顯著低于SASP組（P＜0.05）。蛋白表達電泳圖見圖1，測定結果見表3。

表2 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達水平測定結果（±s，n＝8）Tab 2 Determination results of NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA expressions in colon tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表2 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA表達水平測定結果（±s，n＝8）Tab 2 Determination results of NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA expressions in colon tissue of rats in each group（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SASP組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. SASP group，ΔP＜0.05

組別正常組模型組SASP組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組NF-κB p65 0.63±0.06 1.24±0.11＊1.02±0.09＊#1.08±0.12＊#0.96±0.10＊#0.81±0.05＊#Δ劑量，g/kg 0.3 3.9 7.8 11.7 IκB-α 0.33±0.04 0.74±0.09＊0.66±0.04＊#0.63±0.07＊#0.55±0.04＊#Δ0.47±0.05＊#ΔTLR4 0.31±0.02 0.98±0.10＊0.75±0.06＊#0.85±0.11＊#Δ0.72±0.09＊#0.43±0.11＊#Δ

圖1 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoresis charts of NF-κB p65，IκB-α，TLR4 protein expressions in colon tissue of rats in each group

表3 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達水平測定結果（±s，n＝8）Tab 3 Determination results of NF-κB p65，IκB-α，TLR4 protein expressions in colon tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表3 各組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4蛋白表達水平測定結果（±s，n＝8）Tab 3 Determination results of NF-κB p65，IκB-α，TLR4 protein expressions in colon tissue of rats in each group（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SASP組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. SASP group，ΔP＜0.05

組別正常組模型組SASP組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組TLR4/β-actin 0.25±0.02 0.56±0.05＊0.40±0.03＊#0.41±0.05＊#0.38±0.03＊#0.30±0.01＊#Δ劑量，g/kg 0.3 3.9 7.8 11.7 NF-κB p65/β-actin 0.32±0.02 0.96±0.09＊0.89±0.09＊#0.71±0.07＊#Δ0.59±0.04＊#Δ0.53±0.02＊#ΔIκB-α/β-actin 0.15±0.03 0.39±0.04＊0.33±0.02＊#0.35±0.03＊#0.24±0.02＊#Δ0.19±0.01＊#Δ

4 討論

UC屬于炎癥性腸病范疇，流行病學調查顯示其發病率呈逐年上升趨勢，對患者生命健康及生活質量造成嚴重影響。目前普遍認為UC的發病原因與環境、遺傳及免疫反應、炎癥反應等因素有關，其中免疫因素在UC發病中起重要作用[6-7]。隨著分子生物學技術的快速發展及對TLRs/NF-κB的研究，部分結果初步闡明通過抑制該通路中的NF-κB、TLR4等關鍵分子能阻斷UC進展中過激的炎癥反應，為治療UC提供了新的契機[8]。

TLRs是機體先天免疫系統的主要調控因子，能識別并結合多種病原體相關分子，啟動信號轉導。TLR4是TLRs家族中最早發現的成員，主要通過識別脂多糖啟動相關信號轉導通路，促進NF-κB抑制蛋白激酶IKK的活化，最終激活NF-κB，調控炎癥因子表達[9]。劉杰民等[10]研究表明，TLR4在正常人結腸黏膜組織中的表達量極低，而在結腸炎癥黏膜中的表達量明顯升高。該結果也再次證明了TLR4在UC發病中的重要作用。NF-κB是廣泛存在于組織細胞內的核轉錄因子，能與基因啟動子或增強子的IκB結合，啟動許多炎癥因子的基因轉錄調控，參與UC在內的多種炎性疾病的發病。NF-κB屬于Rel家族，主要由RelA p65、p50、p52，RelB及c-Rel 5個成員構成，其中RelA p65是其主要亞單位，具有明顯的促炎活性。正常狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB-α形成復合體，處于沉默狀態，當細胞受到外界刺激時誘使 IκB-α磷酸化后與NF-κB解離，NF-κB入核調控下游炎癥因子的轉錄表達，促進炎癥因子釋放到胞質發生炎癥反應[11]。

SASP是治療UC患者常用的藥物，其作用機制主要是通過改變腸道微生物體系以及黏膜內前列腺素的合成及電解質交換，最終實現抑制自然殺傷細胞、淋巴細胞及中性粒細胞和巨噬細胞，達到治療的效果。

半夏瀉心湯以半夏為君藥，具有散結消痞、降逆止嘔的作用；干姜、黃芩、黃連為臣藥，具有溫中散寒、苦寒泄熱開痞之功效；其余藥物為輔藥；全方寒熱并用以調節陰陽，辛苦并進以調其升降，補瀉兼施以顧虛實。本研究結果顯示，半夏瀉心湯對UC大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白表達具有較好的抑制作用，且具有一定量效關系，其中半夏瀉心湯高劑量組大鼠結腸組織中NF-κB p65、IκB-α、TLR4 mRNA及蛋白表達水平均顯著低于SASP組，但仍然顯著高于正常組?？梢?，半夏瀉心湯能通過抑制TLR4的表達，減少IκB-α的磷酸化降解，促使NF-κB與IκB-α結合，抑制NF-κB的活化，進而減輕大鼠結腸炎癥反應，發揮其治療UC的作用。

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（

編輯：林 靜）

Effect of Banxia Xiexin Decoction on Expression of TLRs/NF-κB Pathway Related Factors in Colon Tissue of Rats with Ulcerative Colitis

ZHAO Zengqiang（Dept.of TCM，Nanyang Medical College，Henan Nanyang 473061，China）

OBJECTIVE：To observe the effect of Banxia Xiexin decoction on nuclear transcription factor κB p65（NF-κB p65），NF-κB inhibitory protein α（IκB-α）and Toll-like receptor 4（TLR4）in colon tissue of rats with ulcerative colitis（UC），and explore the possible mechanism for UC treatment.METHODS：Rats were randomly divided into normal group（normal saline），model group（normal saline），Sulfasalazine enteric coated tablet（SASP，positive group，0.3 g/kg），Banxia Xiexin decoction low-dose，medium-dose，high-dose groups（3.9，7.8，11.7 g/kg），8 in each group.Except for normal group，other groups were used trinitrobenzene sulfonic acid-ethanol method to reduce UC model.After modeling，they were administrated，ig，once a day，for 3 weeks.After administration，NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA and protein expressions in colon tissue of rats in each group were detected.RESULTS：Compared with normal group，NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA and protein expressions in colon tissue of rats in other groups were significantly increased（P＜0.05）.Compared with model group，NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA and protein expressions in colon tissue of rats in each administration group were significantly decreased（P＜0.05）；showing certain dose-dependent，and the decreasing degree of above indexes in colon tissue of rats in Banxia Xiexin decoction high-dose group were higher than SASP group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Banxia Xiexin decoction can down-regulate the NF-κB p65，IκB-α，TLR4 mRNA and protein expressions in colon tissue of UC rats，which may be one of the mechanisms for UC treatment.

Banxia Xiexin decoction；Ulcerative colitis；Nuclear transcription factor κB p65；NF-κB inhibitory protein α；Toll-like receptor 4

R285

A

1001-0408（2017）22-3095-04

2016-11-21

2017-05-22）

＊碩士，講師。研究方向：中醫藥防治腦血管及消化系統疾病。電話：0377-63526128。E-mail：zjlzjlny@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.19