液態發酵法合成雪峰蟲草活性成分的初步研究Δ

劉 莎，張小娟，王 煒，陳 林，廖 彥，魯耀邦，唐映紅，崔培梧#（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中藥藥性與藥效實驗室，長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中藥民族藥物創新與發展實驗室，長沙 410208）

液態發酵法合成雪峰蟲草活性成分的初步研究Δ

劉 莎1，2＊，張小娟1，2，王 煒1，3，陳 林1，2，廖 彥1，2，魯耀邦1，2，唐映紅1，2，崔培梧1，2#（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中藥藥性與藥效實驗室，長沙 410208；3.湖南中醫藥大學中藥民族藥物創新與發展實驗室，長沙 410208）

目的：探索液態發酵法合成雪峰蟲草活性物質的基礎工藝，為雪峰蟲草資源的綜合開發提供必要技術支持。方法：利用液態發酵技術對雪峰蟲草菌絲體進行培養，并通過培養基組成和培養條件控制來實現活性物質的高效合成。以雪峰蟲草菌為出發菌株，分別考察不同碳源（蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉）、不同氮源（蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀和尿素）、不同維生素B（維生素B1和復合維生素B）和不同初始pH（pH為4、5、6、7、8、9）對雪峰蟲草菌絲生長和胞外多糖、胞內多糖、蟲草酸、胞內三萜合成的影響，進而篩選最佳培養基成分。結果：最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為酵母浸粉，最佳維生素B為維生素B1，最佳初始pH為8。在碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、添加0.1 g/L維生素B1和初始pH為8時可得到較高的生物量和代謝產物積累水平。結論：雪峰蟲草可在液態發酵體系高效積累代謝產物；可通過發酵過程優化控制，實現該菌株細胞生長和活性代謝產物合成的優化。

雪峰蟲草；活性成分；液態發酵；生物合成

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]為我國傳統名貴滋補中藥，已有500余年的應用歷史，具有調節免疫、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[1-3]。但由于連年掠奪式采挖和生態環境的退化，我國蟲草資源日趨匱乏。因此，發掘冬蟲夏草替代品成為解決現有蟲草資源危機的主要手段。雪峰蟲草（Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov）是線蟲草菌科線蟲草菌屬的一個新種，也是目前全球報道個體最大的蟲草，因產于雪峰山脈，故名“雪峰蟲草”[4]。雪峰蟲草作為瑤藥在唐朝就有記載，具有補肺益腎、止咳化痰之功效，配伍后對高血壓、病毒性肝炎、類風濕性關節炎、痛風等癥亦有良好療效[5-6]。真菌分類學和分子生物學鑒定結果顯示，雪峰蟲草與冬蟲夏草親緣關系最近，且含有與冬蟲夏草相同的腺苷、蟲草素、蟲草酸、多糖、甾醇等活性成分[6-8]，這意味著雪峰蟲草具有開發成冬蟲夏草替代品的獨特潛質。

藥用菌物的傳統人工栽培手段存在生長周期長、易受自然環境影響、產品質量穩定性差等不足，而藥用菌物的發酵培養技術卻可明顯改善上述不足，并已被廣泛應用于冬蟲夏草[9]、蛹蟲草[10]、靈芝[11]、茯苓[12]等名貴菌物活性成分的高效合成。因此，探索液態發酵體系雪峰蟲草活性物質的合成規律，對于其目標代謝產物的定向合成、促進雪峰蟲草的高效綜合開發具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

LB-85A雙層恒溫振蕩培養箱（金壇市博朗儀器制造有限公司）；MJX-250BX霉菌培養箱、DGF-4AB立式電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；UV-5100B紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；PH1MV pH計（上海理達儀器廠）；GL-21M立式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 菌株

Ophiocordyceps xuefengensis CCTCC M 2015777，由湖南師范大學生命科學學院真菌研究室陳作紅教授分離、鑒定為雪峰蟲草菌株，并保藏于中國典型培養物保藏中心。

1.3 藥品與試劑

熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201220，純度：≥99%）；維生素B1片（華中藥業股份有限公司，批號：20150814，規格：10 mg/片）；復合維生素B片（威海南波灣生物技術有限公司，批號：20120419，規格：500 mg/片）；甘露醇對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J14D6R7494，純度：≥99%）；葡萄糖、蔗糖、乙酸銨及其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 菌種活化

取保藏的雪峰蟲草菌種，轉接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上，在28℃下培養10 d，然后轉接至不含瓊脂的馬鈴薯葡萄糖培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，于28℃、180 r/min振蕩培養6 d，作為二級菌種。

2.2 培養基的單因素篩選

2.2.1 碳源篩選 以10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎培養基，分別加入30 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉，裝液量為100 mL/250 mL，滅菌后接種5%種子培養液，于28℃、180 r/min振蕩培養6 d，分析菌絲生長和代謝產物的合成情況。

2.2.2 氮源篩選 以30 g/L葡萄糖、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎培養基，分別加入10 g/L的酵母浸粉、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸鉀、尿素，其他操作方法同“2.2.1”項下碳源篩選部分。

2.2.3 生長因子篩選 以30 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎培養基，分別加入0.1 g/L的維生素B1、復合維生素B，并以不加維生素為空白對照組，其他操作方法同“2.2.1”項下碳源篩選部分。

2.2.4 培養基初始pH的篩選 以30 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎培養基，用1 mol/L氯化氫或1 mol/L氫氧化鈉將其初始pH值調為4、5、6、7、8、9，其他操作方法同“2.2.1”項下碳源篩選部分。

2.3 相關分析方法

2.3.1 生物量的測定 培養結束后取發酵液50 mL，過濾后用蒸餾水洗滌3次，然后于60℃烘箱烘至恒質量，分析天平稱質量后并將單位換算為g/L。

2.3.2 胞外多糖的測定 收集除去菌體的發酵液，經30%（V/V）乙醇沉淀以去除雜蛋白，向上清液繼續添加乙醇至70%（V/V），劇烈攪拌后在4℃冰箱靜置過夜，于4 500×g離心10 min。收集沉淀，并向沉淀中加4倍量95%乙醇洗滌3次，于60℃烘干，即得胞外粗多糖。采用Sevage法對粗多糖進行純化，然后采用苯酚-硫酸法[12-13]測定其含量。

2.3.3 胞內多糖的測定 收集50 mL發酵液的菌絲體，并在60℃烘箱烘至恒質量，然后于研缽中充分研磨成精細粉末，加入100 mL蒸餾水后于沸水浴中回流提取3次，每次提取1 h。趁熱用布氏漏斗過濾并合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮至約10 mL，繼續添加乙醇至70%（V/V），劇烈攪拌后在4℃冰箱靜置過夜，于 4 500×g離心10 min。收集沉淀，并向沉淀中加4倍量95%乙醇洗滌3次，于60℃烘干，即得胞內粗多糖。采用Sevage法對粗多糖進行純化，然后采用苯酚-硫酸法[12-13]測定其含量。

2.3.4 蟲草酸的測定 采用高碘酸鈉比色法測定[14]。將干燥后雪峰蟲草菌絲體于研缽中充分研磨成精細粉末，加入一定體積蒸餾水后于超聲波細胞粉碎機中粉碎20 min（冰浴，功率500 W，工作10 s，停留10 s），然后于4 500×g離心10 min。收集上清液，并作適量稀釋后取1 mL稀釋液，加入1 mL高碘酸鈉試液后，室溫放置10 min。加2 mL 0.1%鼠李糖，再加4 mL新配制的納什試劑，53℃水浴15 min，用分光光度計在420 nm波長處測吸光度，按回歸方程計算蟲草酸含量。

2.3.5 胞內三萜的測定 采用香草醛-高氯酸顯色法[15]測定。精密稱取雪峰蟲草干菌體粉末0.03 g，加入5 mL甲醇，水浴80℃提取2 h，4 500×g離心10 min。精密吸取上清液1 mL，水浴加熱揮干，分別加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，再加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后用分光光度計在548 nm波長處測吸光度，按回歸方程計算胞內三萜含量。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 不同碳源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響

碳源是細胞生長和代謝產物合成所需碳元素骨架的主要來源，菌絲體在代謝過程中往往會依據碳源的類型作出相應的調整，并有不同的代謝產物合成規律[16]。為尋找最優碳源，本研究考察了蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉分別作為碳源時雪峰蟲草的代謝特征，結果見圖1。

圖1 不同碳源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響（±s，n＝3）Fig 1 Effects of different carbon sources on the mycelial growth and metabolites synthesis of O.xuefengensis（±s，n＝3）

由圖1可知，以蔗糖為碳源時，雪峰蟲草的生物量最高，含量為（3.51±0.12）g/L，且同時可獲得最高含量的蟲草酸和胞內三萜，分別為（314.96±13.31）mg/g和（8.97±0.24）mg/g，這些指標與葡萄糖組和可溶性淀粉組比較差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；當以可溶性淀粉為碳源時，唯有胞外多糖和胞內多糖含量比蔗糖組高，而生物量、蟲草酸和胞內三萜含量顯著下降，推測為未完全消耗的淀粉對多糖分析結果產生了影響。因此，蔗糖為最佳碳源。

3.2 不同氮源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響

氮源為細胞生長和產物合成的另一重要因素，按照其化學組成可分為無機氮源和有機氮源。本實驗選擇了蛋白胨、酵母浸粉和酵母浸膏為有機氮源，硝酸鈉、硝酸鉀和尿素為無機氮源，分別考察了其對雪峰蟲草代謝的影響，結果見圖2。

由圖2可知，與蛋白胨組比較，無機氮源組除胞外多糖含量比蛋白胨組高外，其他指標均顯著降低，故在后續實驗過程中舍棄無機氮源。在有機氮源中，酵母浸粉組可收獲最高含量的胞外多糖、胞內多糖和胞內三萜，分別為（2.20±0.03）g/L、（76.29±2.81）mg/g、（8.76± 0.40）mg/g；而酵母浸膏組可收獲最高含量的生物量和蟲草酸，分別為（10.83±0.47）g/L、（149.59±6.30）mg/g，均略高于酵母浸粉組的（10.25±0.32）g/L、（132.83± 5.88）mg/g，但胞外多糖、胞內多糖和胞內三萜卻顯著低于酵母浸粉組。因此，最佳氮源為酵母浸粉。

圖2 不同氮源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響（±s，n＝3）Fig 2 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth and metabolites synthesis of O. xuefengensis（±s，n＝3）

3.3 不同維生素B對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響

維生素B參與了眾多次級代謝的調節，在藥用菌物的發酵培養基中常用作重要的生長因子[17]。本實驗考察了維生素B1和復合維生素B對雪峰蟲草液態發酵過程中代謝的影響，結果見圖3。

由圖3可知，與空白對照組比較，維生素B1組表現出顯著的菌絲生長促進和代謝產物合成促進效應；而與維生素B1組比較，復合維生素B組僅在胞內三萜方面有優勢。因此，培養基中加入維生素B1可顯著促進雪峰蟲草代謝產物的積累。

3.4 初始pH對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響

培養基初始pH對細胞的酶反應速率和代謝途徑調控起著關鍵作用。本實驗分別考察了培養基初始pH為4、5、6、7、8、9時的雷峰蟲草代謝特征，結果見圖4。

圖4 不同初始pH對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產物合成的影響（±s，n＝3）Fig 4 Effects of different initial pH on the mycelial growth and metabolites synthesis of O.xuefengensis（±s，n＝3）

由圖4可知，在pH為8時可收獲最高含量的生物量、胞內多糖、蟲草酸，分別為（3.49±0.02）g/L、（32.10± 0.96）mg/g、（283.85±4.12）mg/g；而pH為7時可收獲最高含量的胞內三萜（20.32±0.25）mg/g，略高于pH為8時的（19.16±0.12）mg/g；pH為5時胞外多糖含量最高為（1.06±0.02）g/L，但其他指標嚴重降低。因此，選擇pH為8時可獲得最高的發酵效率。

4 討論

藥用菌物發酵技術的快速發展為實現其活性成分的生物合成提供了較好的思路，也是中醫藥現代化發展過程中對菌物藥充分發掘的有效手段[9-11]。雪峰蟲草為湖湘特色民族藥物，已有500余年的應用歷史，但隨著地方特色民族藥物資源的快速開發，雪峰蟲草的野生資源被快速消耗。因此，嘗試以液態發酵技術對其菌絲體進行培養，并通過培養基組成和培養條件控制來實現活性物質的高效合成，將為雪峰蟲草資源的綜合開發提供必要的技術支持。

本研究以雪峰蟲草菌為出發菌株，從碳源、氮源、維生素B、培養基初始pH方面對其菌絲生長和胞外多糖、胞內多糖、蟲草酸、胞內三萜的積累水平進行了綜合分析，結果顯示在碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、添加0.1 g/L維生素B1和初始pH為8時可得到較高的生物量和代謝產物積累水平，說明可通過發酵過程優化控制，實現該菌株細胞生長和活性代謝產物合成的優化。從實驗數據還可看出，不同代謝產物對不同的營養因子或發酵條件有不同的響應，且菌株細胞生長和產物合成往往對營養因子和培養條件也有不同的需求。因此，若以開發雪峰蟲草野生資源的替代品為目標，須重視多種活性成分合成的協同調控。今后本課題組將圍繞培養基及培養條件多因子的綜合調控及其過程放大進行深入研究。

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Primary Study on the Synthesis of Active Ingredients of Ophiocordyceps xuefengensis by Submerged Fermentation Method

LIU Sha1，2，ZHANG Xiaojuan1，2，WANG Wei1，3，CHEN Lin1，2，LIAO Yan1，2，LU Yaobang1，2，TANG Yinghong1，2，CUI Peiwu1，2（1.College of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.TCM Potency&Efficacy Laboratory，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.TCM and Ethnomedicine Innovation&Development Laboratory，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

OBJECTIVE：To explore basic technology for synthesis of active ingredients of Ophiocordyceps xuefengensis，and provide necessary technical support for comprehensive development of O.xuefengensis sourse.METHODS：Submerged fermentation method was used to cultivate the mycelium，achieving efficient synthesis of active ingredients by controlling medium composition and cultivation conditions.Using the bacteria as starting strain，the effects of different carbon sources（sucrose，glucose and soluble starch），different nitrogen sources（peptone，yeast extract powder，yeast extract，sodium nitrate，potassium nitrate and urea），different vitamin B（vitamin B1and vitamin B complex）and different initial pH（pH was set at 4，5，6，7，8 and 9，respectively）on mycelial growth，extracellular and intracellular polysaccharide synthesis，cordycepin synthesis and intracellular triterpenoid synthesis were investigated to screen the optimal medium composition.RESULTS：The optimal carbon source，nitrogen source，vitamin B and initial pH were sucrose，yeast extract powder，vitamin B1and 8，respectively.High biomass and metabolite accumulation levels can be obtained when carbon source was sucrose，nitrogen source was yeast extract powder，adding 0.1 g/L vitamin B1with initial pH of 8.CONCLUSIONS：O.xuefengensis can efficiently accumulate metabolites，and achieve the optimization of strain cell growth and synthesis of active metabolite by optimizing and controlling the fermentation process.

Ophiocordyceps xuefengensis；Active ingredient；Submerged fermentation；Biosynthesis

R965.2

A

1001-0408（2017）22-3079-05

2016-11-07

2017-02-08）

（編輯：余慶華）

湖南省科技重大專項子項目（No.2014FJ1007）；湖南中醫藥大學“十二五”校級重點學科項目（No.校行科字〔2012〕2號）

＊碩士研究生。研究方向：藥用菌物活性成分挖掘及其生物合成研究。電話：0731-88458225。E-mail：1099570752@qq.com

#通信作者：講師，博士研究生。研究方向：藥用菌物活性物質基礎及其代謝工程研究。電話：0731-88458225。E-mail：cuipeiwu@126. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.15