參附注射液對(duì)慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miRNA表達(dá)譜的影響Δ

施 洋，樊官偉（1.克拉瑪依市人民醫(yī)院藥劑科，新疆克拉瑪依 834000；2.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

參附注射液對(duì)慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miRNA表達(dá)譜的影響Δ

施 洋1，2，3＊，樊官偉2，3#（1.克拉瑪依市人民醫(yī)院藥劑科，新疆克拉瑪依 834000；2.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

目的：研究參附注射液（SFI）對(duì)慢性充血性心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰）大鼠心肌微小RNA（miRNA）表達(dá)譜的影響，以明確SFI抗心衰的作用靶點(diǎn)。方法：將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組（生理鹽水，ip）、模型組（生理鹽水，ip）、纈沙坦組（陽(yáng)性對(duì)照，10 mg/kg，ig）和SFI組（0.75 mL/kg，im），每組10只，除假手術(shù)外的其余各組大鼠均復(fù)制心衰模型。造模成功后，各組小鼠每天給予相應(yīng)藥物1次，連續(xù)給藥28 d后采用Affymetrix miRNAV4.0芯片技術(shù)對(duì)心衰大鼠心肌組織中miRNA表達(dá)進(jìn)行分析，并篩選各組大鼠心肌組織中共同差異表達(dá)miRNA，以差異基因表達(dá)倍數(shù)大于或等于1.1為閾值分析心衰相關(guān)miRNA；利用基因本體論（GO）分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類及生物信號(hào)通路分析。結(jié)果：共篩選出29條共同差異表達(dá)miRNA，7條心衰相關(guān)miRNA（rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p和rno-miR-1-3p），SFI能顯著下調(diào)心衰大鼠心肌組織中rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-1-3p表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA主要與信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞質(zhì)及核苷酸結(jié)合有關(guān)。結(jié)論：SFI參與下調(diào)心衰進(jìn)展相關(guān)miRNA，進(jìn)而經(jīng)細(xì)胞質(zhì)與核苷酸結(jié)合后影響相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮其抗心衰作用。

參附注射液；慢性充血性心力衰竭；微小RNA；差異篩選；基因本體論分析

慢性充血性心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰），是由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致的心室充盈或射血能力受損所致的一組復(fù)雜的臨床綜合征，已成為嚴(yán)重危害人類健康的頑疾之一，具有發(fā)病率高、病情危重、病死率高、預(yù)后不良等特點(diǎn)，其5年生存率與惡性腫瘤相仿[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)現(xiàn)有約1 000萬(wàn)左右心衰患者，發(fā)病率為2%～3%，住院30 d的病死率為5.4%[2-3]。降低心衰患者病死率，延長(zhǎng)心衰患者壽命并提高其生活質(zhì)量已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界共同致力研究的焦點(diǎn)。

1 材料

1.1 儀器

Scanner3000型掃描儀、Hybridization Oven640型雜交爐、Fluidics Station450型洗滌工作站（美國(guó)Affymetrix公司）；UV1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；G2939A型2100質(zhì)檢儀（美國(guó)Agilent公司）；2000型NanoDrop RNA濃度檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo公司）；9700型定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR）儀（美國(guó)ABI公司）；LX-300型離心機(jī)（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

SFI（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)：141001010，規(guī)格：10 mL/支）；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X1711，規(guī)格：80 mg/粒）；注射用青霉素鈉（石家莊制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：017140617，規(guī)格：0.96 g/瓶）；FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit（RNA標(biāo)記試劑盒，美國(guó)Affymetrix公司）；GeneChip?Hybridization，Wash，and Stain Kit（基因芯片雜交、洗滌、染色試劑盒，美國(guó)Affymetrix公司）；mirVanaTMRNAIsolation KitAM1556（miRNA提取試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量（240±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[合格證號(hào)：SCXK-（京）2012-0001]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組（陽(yáng)性對(duì)照）及SFI組，每組10只。除假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)外（只穿線不結(jié)扎），其余各組大鼠均采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)造成大鼠心肌梗死。術(shù)后連續(xù)ip青霉素鈉3 d抗感染，籠中飼養(yǎng)4周后檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)，若小于或等于35%則判定心衰模型造模成功[8-10]。造模成功后，纈沙坦組大鼠ig纈沙坦膠囊水溶液（10 mg/kg，根據(jù)臨床用量換算而得），SFI組大鼠im SFI（0.75 mL/kg，根據(jù)臨床用量換算而得），假手術(shù)組和模型組大鼠ip生理鹽水（10 mL/kg），每天1次，連續(xù)28 d。

我國(guó)在胸痛中心成立前，對(duì)于STEMI患者的救治多采用“綠色通道”和優(yōu)化急救流程的方式，縮短救治時(shí)間［7-9］，但效果并不理想。目前我國(guó)已成立一千多家胸痛中心，并在治療這類患者中發(fā)揮了重要作用［10］。全國(guó)各地胸痛中心成立后，對(duì) STEMI患者的救治方面產(chǎn)生了積極的影響。但目前以STEMI為代表的急性胸痛患者診療流程仍存在一些問(wèn)題，因此，了解胸痛中心的救治現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題很有必要，同時(shí)可以為提出改進(jìn)措施提供依據(jù)。

2.2 總RNA提取

給藥結(jié)束后，處死大鼠，取梗死邊緣區(qū)心肌組織200 mg，立即浸入液氮中迅速降溫后置于－80℃超低溫冰箱中保存，備用。按照mRNA提取試劑盒的相關(guān)操作說(shuō)明進(jìn)行操作，提取心肌組織中的總RNA。

2.3 Affymetrix miRNAV 4.0表達(dá)譜芯片試驗(yàn)

取提取的心肌組織總RNA，采用分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)為260、280 nm處測(cè)定其吸光度（A），A260/A280比值在1.8～2.0之間為較純RNA。通過(guò)2100質(zhì)檢儀對(duì)RNA進(jìn)行檢測(cè)，定義RNA分子完整數(shù)（RIN）≥7且28S/18S≥0.7為質(zhì)量合格RNA。然后依次經(jīng)過(guò)加尾、生物素標(biāo)記、雜交、洗滌、染色和掃描等步驟完成表達(dá)譜芯片試驗(yàn)。此項(xiàng)工作由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2.4 差異表達(dá)miRNA分析

將假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組、SFI組4個(gè)組按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行兩兩配對(duì)，得到假手術(shù)組與模型組、模型組與纈沙坦組、模型組與SFI組3個(gè)配對(duì)組，分別對(duì)經(jīng)表達(dá)譜試驗(yàn)篩選的差異miRNA進(jìn)行列表比較，從而得到各配對(duì)組差異表達(dá)miRNA。再取上述3個(gè)配對(duì)組交集，得到各組共同差異表達(dá)miRNA，運(yùn)用Q-PCR儀定量檢測(cè)差異miRNA的表達(dá)水平。之后查閱文獻(xiàn)并以差異基因表達(dá)倍數(shù)值大于或等于1.1為閾值挑選出與心衰相關(guān)miRNA，以假手術(shù)組和模型組分別作為基準(zhǔn)，對(duì)比給藥前后心衰相關(guān)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有試驗(yàn)均平行3次，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和客觀性。

2.5 基因功能GO分析

對(duì)表達(dá)譜芯片試驗(yàn)篩選得到的所有具有差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析，從而描述該基因的功能。該分析主要從3個(gè)方面進(jìn)行描述，即生物途徑、細(xì)胞組分和細(xì)胞分子功能。統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中所包括的差異基因數(shù)目并計(jì)算其富集的顯著性。當(dāng)富集度＞0時(shí)，表明顯著性GO上調(diào)；富集度＜0時(shí)，表明顯著性GO下調(diào)；若P值相同，那么GO富集度越大，則意味著該功能受試驗(yàn)的影響越大（富集度大小用轉(zhuǎn)錄域覆蓋率表示，轉(zhuǎn)錄域覆蓋率越大表明富集度越高）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 3個(gè)配對(duì)組的差異表達(dá)miRNA分析結(jié)果

將假手術(shù)組與模型組、模型組與纈沙坦組以及模型組與SFI組分別進(jìn)行配對(duì)比較并篩選差異miRNA后，得到共同差異表達(dá)miRNA 29條。其中，假手術(shù)組、模型組和SFI組共同差異表達(dá)miRNA 38條；假手術(shù)組、模型組和纈沙坦組共同差異表達(dá)miRNA 47條；模型組、纈沙坦組和SFI組共同差異表達(dá)miRNA36條，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3個(gè)配對(duì)組的差異表達(dá)miRNA交集圖Fig 1 Intersection diagram of miRNAs on differential expression in 3 matched groups

3.2 心衰相關(guān)miRNA表達(dá)差異分析結(jié)果

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)[7，11-12]和miRNA的篩選結(jié)果，挑選出了7條與心衰相關(guān)的miRNA，即rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p和rno-miR-1-3p。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中篩選出的7個(gè)心衰相關(guān)miRNA表達(dá)均上調(diào)，其中rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p、rno-miR-1-3p差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥28 d后，與模型組比較，纈沙坦組和SFI組大鼠心肌組織中7個(gè)心衰相關(guān)miRNA表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，其中rnomiR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p和rnomiR-1-3p差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。該試驗(yàn)結(jié)果表明，SFI發(fā)揮抗心衰作用的機(jī)制與下調(diào)心衰相關(guān)miRNA的表達(dá)有密切聯(lián)系。心衰相關(guān)7個(gè)miRNA表達(dá)差異結(jié)果見(jiàn)表1，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 心衰相關(guān)7個(gè)miRNA表達(dá)差異結(jié)果Tab 1 Results of expression differences of 7 miRNAs associated with heart failure

圖2 心衰相關(guān)7個(gè)miRNA表達(dá)差異統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（n＝3）Fig 2 Statistical analysis results of expression differences of 7 miRNAs associated with heart failure（n＝3）

3.3 差異基因GO分析結(jié)果

GO分析結(jié)果顯示，在生物途徑方面，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因占7.5%，包括低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；在細(xì)胞組成方面，細(xì)胞質(zhì)相關(guān)的差異表達(dá)基因占38.8%，其余有細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體等；在分子功能方面，與結(jié)合有關(guān)的差異基因占71.4%，主要為核苷酸結(jié)合（20%）、蛋白結(jié)合（19.2%）、金屬離子結(jié)合（17.4%）和三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合（14.8%），結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 差異基因GO分析結(jié)果Fig 3 GO analysis results of differential genes

4 討論

miRNA基因芯片檢測(cè)原理與DNA、RNA芯片相近，即用標(biāo)記物對(duì)總體RNA樣本進(jìn)行標(biāo)記，然后與miRNA芯片雜交，通過(guò)掃描芯片上綠光信號(hào)的強(qiáng)度，計(jì)算出該樣品中miRNA的表達(dá)量，從而了解該樣品中miRNA表達(dá)的異常情況。目前該技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域主要應(yīng)用于疾病相關(guān)研究和藥物研發(fā)中，是一種較快的研究miRNA表達(dá)的方法。纈沙坦是一種血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗藥，其對(duì)AngⅡ的Ⅰ型受體（AT1）有高度選擇性，可通過(guò)阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，從而產(chǎn)生降壓作用。長(zhǎng)期應(yīng)用纈沙坦，可抑制血管重塑、提高心功能、降低心血管事件的發(fā)生率[13-15]。此外，該藥不良反應(yīng)少、安全性高、耐受性好，故常作為心肌梗死、心衰、糖尿病、高血壓等患者的常規(guī)用藥，故在本研究中以其為陽(yáng)性對(duì)照藥。

GO是“Gene Ontology”的縮寫(xiě)，譯為基因本體論，可分為分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成3個(gè)部分。通過(guò)對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析，可對(duì)該基因的功能進(jìn)行描述。蛋白質(zhì)或者基因可通過(guò)身份識(shí)別對(duì)應(yīng)或序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的GO號(hào)，而GO號(hào)可對(duì)應(yīng)找到相應(yīng)的類別，即功能分類或細(xì)胞定位。GO分析目前已廣泛應(yīng)用于分子生物領(lǐng)域，其對(duì)靶基因的篩選和細(xì)胞信號(hào)通路的預(yù)測(cè)有著重要而深遠(yuǎn)的作用[16]。

Li J等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30家族在抑制細(xì)胞凋亡方面具有重大意義，其可抑制細(xì)胞抑癌基因P53的表達(dá)，阻止線粒體的分裂，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。而miR-30c是miR-30家族的一員，其在心肌細(xì)胞中高表達(dá)。van Rooij E等[18]通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性心力衰竭患者心臟組織中miRNA表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性心力衰竭過(guò)程心臟組織中miRNA表達(dá)失調(diào)，其中miR-125、miR-199a表達(dá)顯著升高。miR-133a在維持心臟細(xì)胞外基質(zhì)平衡中占重要地位，當(dāng)其表達(dá)異常時(shí)，會(huì)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)畸形，并存在嚴(yán)重的心肌纖維化，最終導(dǎo)致心衰[19-20]。有學(xué)者認(rèn)為，miR-221可通過(guò)調(diào)控p27/CDK2/mTOR通路介導(dǎo)的自噬抑制誘發(fā)心衰，是心肌細(xì)胞內(nèi)自噬調(diào)控的關(guān)鍵因子[21]。miR-146a通過(guò)對(duì)靶基因Smad4進(jìn)行調(diào)控，可減弱對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用，而TGF-β/ Smads信號(hào)通路與心肌纖維化及心衰密切相關(guān)[22]。miR-1雖然能抑制心肌細(xì)胞發(fā)達(dá)，但卻會(huì)負(fù)性調(diào)節(jié)心肌缺血損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在缺氧或過(guò)氧化氫及高糖環(huán)境下均可使miR-1表達(dá)水平升高[23-25]。筆者通過(guò)對(duì)上述7種miRNA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，SFI能不同程度地下調(diào)心衰大鼠心肌組織中rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p及rno-miR-1-3p的表達(dá)水平，且對(duì)rnomiR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p和rnomiR-1-3p的下調(diào)作用最為明顯。

綜上所述，大鼠心衰過(guò)程中，7個(gè)心衰相關(guān)miRNA表達(dá)均明顯上調(diào)；SFI參與下調(diào)心衰進(jìn)展相關(guān)的miRNA，包括rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p及rno-miR-1-3p等，進(jìn)而經(jīng)細(xì)胞質(zhì)與核苷酸結(jié)合后影響某些信號(hào)通路（如HIF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等）的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮其抗心衰的作用。

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Effect of Shenfu Injection on the Expression Profile of Myocardial miRNA in Rats with Chronic Congestive Heart Failure

SHI Yang1，2，3，F(xiàn)AN Guanwei2，3（1.Dept.of Pharmacy，Karamay Municipal Peoples’Hospital，Xinjiang Karamay 834000，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine/Breeding Base，State Key Laboratory/Research Institute of TCM for Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China；3.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of TCM，Ministry of Education，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Shenfu injection（SFI）on the expression profile of myocardial miRNA in rats with chronic congestive heart failure（referring to heart failure）.METHODS：40 rats were randomly divided into sham operation group（normal saline，ip），model group（normal saline，ip），valsartan group（positive control，10 mg/kg，ig）and SFI group（0.75 mL/kg，im），10 in each group.Except for sham operation group，another groups were reduced heart failure.After modeling，rats in other groups

related medicines，once a day.Affymetrix miRNA V4.0 chip technology was conducted to analyze the miRNA expression in myocardial tissue of rats with heart failure after administration for 28 d，and screen the miRNA on common differential expression in myocardial tissue of rats in each group.The miRNA associated with heart failure was analyzed by threshold of differential gene expression multiple value greater than or equal to 1.1.Gene Ontology（GO）analysis was used to analyze functional classification and biological signaling pathway of differentially expressed genes.RESULTS：There were totally 29 miRNAs on common differential expression and 7 miRNAs associated with heart failure（rno-miR-30c-1-3p，rno-miR-125b-5p，rno-miR-133a-5p，rno-miR-199a-5p，rno-miR-221-3p，rno-miR-146a-5p and rno-miR-1-3p）.SFI can significantly downregulate the expressions of rno-miR-125b-5p，rno-miR-133a-5p，rno-miR-221-3p，rno-miR-1-3p in myocardial tissue of rats（P＜0.05 or P＜0.01）.Results of GO analysis showed，miRNAs on differential expression were mainly related to signal transduction，cytoplasm and nucleotide binding.CONCLUSIONS：SFI plays the role of anti-heart failure by participating in the downregulation of miRNAs associated with heart failure process and then affecting related signal pathways transduction after the combination of cytoplasm and nucleotide.

Shenfu injection；Chronic congestive heart failure；miRNA；Differential screening；Gene ontology analysis

R285

A

1001-0408（2017）22-3048-05

2016-12-01

2017-05-12）

（編輯：林 靜）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）課題（No.2012CB518404）；教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”課題（No.IRT1276）

＊藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)、心血管藥理學(xué)。電話：0990-6865417。E-mail：shiyangtjutcm@126.com

#通信作者：副研究員，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：心血管藥理學(xué)。電話：022-59596163。E-mail：fgw1005@hotmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.07