高碳酸血癥通過賴氨酰氧化酶依賴的膠原蛋白交聯影響大鼠缺氧性肺動脈高壓*

陳偉謙， 彭燕平， 張維溪， 葉樂平， 董 亮， 夏曉東△

(1溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院呼吸內科，浙江 溫州 325027； 2山東大學齊魯醫院呼吸內科，山東 濟南 250012)

高碳酸血癥通過賴氨酰氧化酶依賴的膠原蛋白交聯影響大鼠缺氧性肺動脈高壓*

陳偉謙1， 彭燕平1， 張維溪1， 葉樂平1， 董 亮2， 夏曉東1△

(1溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院呼吸內科，浙江 溫州 325027；2山東大學齊魯醫院呼吸內科，山東 濟南 250012)

目的： 通過研究缺氧和/或高碳酸血癥時賴氨酰氧化酶(LOX)以及細胞外基質膠原蛋白的交聯變化，探討高碳酸血癥對缺氧性肺動脈高壓的影響機制。方法: SD大鼠隨機均分為4組，分別為常氧對照組、缺氧組、高碳酸血癥組以及缺氧+高碳酸血癥組。比色法測定膠原蛋白含量，熒光光譜法分析LOX酶活性，免疫組織化學和Western blot法檢測肺動脈LOX蛋白含量，實時熒光定量PCR檢測肺動脈LOX的mRNA水平。結果: 缺氧組大鼠平均肺動脈壓(mPAP)、右心室/(左心室+室間隔)重量比值[RV/(LV+S)]及血管壁面積(WA)/血管總面積(TA)均明顯高于常氧對照組；高碳酸血癥組與常氧對照組的mPAP、RV/(LV+S)差異無統計學顯著性；缺氧+高碳酸血癥組大鼠的mPAP及RV/(LV+S)顯著低于單純缺氧組。缺氧組大鼠肺組織的膠原交聯程度則明顯高于常氧組及高碳酸血癥組；高碳酸血癥組大鼠肺組織的膠原交聯程度與常氧組比較無顯著差異；缺氧+高碳酸血癥組大鼠肺組織的膠原交聯程度顯著低于缺氧組。缺氧組大鼠肺動脈LOX的mRNA、蛋白表達量及其酶活性均高于常氧組(P<0.01)；缺氧+高碳酸血癥組大鼠肺動脈LOX mRNA、蛋白表達以及酶活性均明顯低于缺氧組(P<0.01)。結論: 缺氧能誘導肺動脈LOX高表達，通過促進膠原合成及交聯，參與肺動脈高壓的形成。高碳酸血癥通過抑制缺氧誘導的LOX表達和膠原交聯，延緩缺氧性肺動脈高壓的進展。

缺氧； 高碳酸血癥； 肺動脈高壓； 賴氨酰氧化酶

肺臟是機體通氣和換氣的重要臟器，常見的呼吸系統疾病如慢性阻塞性肺疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征，往往同時存在通氣和換氣功能障礙，它不僅引發缺氧(O2)，而且常伴隨高碳酸血癥，即二氧化碳(CO2)潴留。目前，基于單純缺氧誘導的肺動脈高壓機制研究較多，但較少有同時涉及高碳酸血癥與缺氧性肺動脈高壓的研究[1]。我們以往研究發現，缺氧合并高碳酸血癥對大鼠肺動脈高壓形成的影響明顯弱于單純缺氧[2-3]。肺動脈高壓的重要病理基礎是肺動脈平滑肌收縮和結構重建，而結構重建又主要表現為平滑肌細胞增殖及細胞外基質沉積。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)則作為媒介彈性蛋白和膠原蛋白基質交聯的關鍵酶在細胞外基質的形成及沉積中發揮作用[4]。為此，本研究建立缺氧及高碳酸血癥大鼠動物模型，通過分析LOX表達、細胞外基質膠原交聯的變化，探討高碳酸血癥對缺氧誘導肺動脈高壓的可能調控機制。

材 料 和 方 法

1 動物模型復制

溫州醫科大學實驗動物中心提供清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體重(200～250)g，隨機均分為4組，分別為常氧組、缺氧組、高碳酸血癥組以及缺氧+高碳酸血癥組，每組8只。對照組呼吸空氣；缺氧組：艙內O2濃度維持在(10±0.5)%，CO2濃度<1%；高碳酸血癥組：艙內O2濃度維持在21%，CO2濃度為(7±0.5)%；缺氧+高碳酸血癥組：艙內O2濃度維持在(10±0.5)%，CO2濃度維持在(7±0.5)%。缺氧組、高碳酸血癥組及缺氧+高碳酸血癥組于上述飼養艙中每天飼養8 h，其余時間與正常對照組同樣條件下處于同一室內呼吸空氣，室溫為(20～25)℃，相對濕度為50%～70%，分別飼養3周[1,3]。

2 主要試劑

Sircol膠原測定及羥脯氨酸比色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；LOX熒光分析試劑盒購自AAT；兔抗大鼠LOX多克隆抗體、β-actin多克隆抗體購自Abcam；RNA快速提取試劑盒購自Generay；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；real-time PCR試劑購自TIANGEN；DAB 顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

3 主要方法

3.1 動脈血氣分析 各組大鼠在飼養最后一天，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，分離右側頸外動脈，用肝素化的血氣分析試管采集動脈血，以ABL800血氣分析儀進行分析。

3.2 一般指標的檢測 大鼠麻醉后，經右頸外靜脈插管至肺動脈，用壓力傳感器連接心導管生理記錄儀測定平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure, mPAP)。放血處死，分離心、肺，剪除心房組織，沿室間隔(septum, S)右側緣剪下右心室(right ventricle, RV)，稱取RV和左心室(left ventricle, LV)+室間隔重量，計算RV/(LV+S)的重量比。肺血管HE染色：取肺組織用多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下應用血管圖像分析儀測定血管壁面積(WA)以及血管總面積(TA)，計算WA/TA的比值，評估肺動脈血管增厚程度以反映肺動脈結構。

3.3 膠原蛋白交聯的測定 膠原蛋白分為可溶(非交聯)及不可溶(交聯)于胃蛋白酶兩部分，后者即交聯的膠原蛋白。取100 mg肺組織勻漿，以含0.5 mmol/L乙酸的胃蛋白酶(5g/L)消化并抽提過夜，4 ℃、2 100×g離心6 min，分離出可溶性及不可溶性膠原蛋白。Bradford法進行蛋白定量。可溶性未交聯的膠原蛋白能在胃蛋白酶的作用下分解，采用Sircol膠原試劑盒測定可溶性膠原蛋白的含量。根據羥脯氨酸比色法測定總的可溶性及不可溶性膠原蛋白的含量(具體按說明書操作)。不可溶性膠原蛋白含量=總的可溶性及不可溶性膠原蛋白含量-可溶性膠原蛋白含量。以不可溶性膠原蛋白/可溶性膠原蛋白表示膠原蛋白交聯程度。

3.4 LOX酶的活性分析 采取熒光光譜法分析LOX酶活性。肺組織勻漿在含有1.2 mmol/L尿素和50 mmol/L硼酸鈉的抽提緩沖液(pH=8.2)中4 ℃孵育過夜，15 000×g離心，取上清液，置于含1.2 mmol/L尿素、50 mmol/L硼酸鈉、1 000 U/L辣根過氧化物酶、50 μmol/L Amplex Red熒光試劑、10 mmol/L 1,5-二氨基戊烷以及添加或不添加β-APN的反應緩沖液，37 °C孵育30 min，檢測LOX催化辣根過氧化物酶耦合的熒光底物釋放H2O2的程度，以熒光光譜儀讀取熒光產物在560 nm激發波長(Ex)時和590 nm發射波長(Em)時的數值，以Ex/Em表示LOX酶活性。

3.5 免疫組織化學法檢測肺動脈LOX蛋白的表達 取5 mm×5 mm×5 mm肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。依次常規脫蠟至水，3% H2O2-甲醇室溫處理，置于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中進行抗原修復。10%羊血清37 ℃封閉15 min，1∶200兔抗大鼠LOX多克隆抗體37 ℃孵育1 h(陰性對照實驗用正常兔血清替代)，1∶100生物素化羊抗兔Ⅱ抗37 ℃孵育10 min，1∶100辣根酶標記鏈酶卵白素37 ℃孵育10 min。再用DAB顯色5～10 min，水洗，蘇木素復染，透明，梯度乙醇脫水，封片，鏡檢。棕黃色顯色為LOX陽性表達。應用圖像度分析軟件分每張切片肺中小動脈的LOX的染色強度。

3.6 Western blot檢測肺動脈LOX的蛋白水平 肺動脈在4 ℃組織裂解液中制成勻漿，12 000×g離心15 min，收集上清。Bradford法測定勻漿總蛋白濃度。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，應用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，轉蛋白至硝酸纖維素膜，3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用1∶400的抗LOX以及1:500的抗β-actin多克隆抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的 II 抗室溫反應2 h，DAB顯色后攝像掃描分析蛋白電泳條帶相對光密度值。

3.7 實時熒光定量PCR檢測肺動脈LOX的mRNA表達 Trizol離心柱法提取分離的肺動脈勻漿總RNA，計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取純度。應用Fermentas的cDNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，-20 ℃保存cDNA。以β-actin為內參照，通過CFX connect Real-Time PCR System定量PCR儀，進行實時熒光(SYBR)定量PCR擴增。反應條件為50 ℃ 3 min、95 ℃ 15 min；95.0 ℃ 10 s、59 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，35個循環后進行熒光檢測及熔解曲線分析。LOX的上游引物序列為5’-GCCTGGACCGTGCTCTTTCT-3’，下游引物序列為 5’-CGTTGTTCTCCCATTGGATTGT-3’，產物為127 bp；β-actin的上游引物序列為5’-GACATAAAGGAGAAGCTGTGC-3’，下游引物序列為 5’-CATGATGGAGTTGAAGGTGGT-3’，產物為219 bp。

4 統計學處理

采用SigmaPlot軟件統計分析數據。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠mPAP、RV/(LV+S)、WA/TA及血氣分析指標的變化

缺氧處理組大鼠mPAP、RV/(LV+S)及WA/TA均明顯高于常氧對照組(P<0.01)。高碳酸血癥處理大鼠與常氧對照組的mPAP、RV/(LV+S)差異無統計學意義；缺氧+高碳酸血癥組大鼠mPAP及RV/(LV+S)顯著低于單純缺氧組(P<0.01)；缺氧+高碳酸血癥組大鼠WA/TA比值下降，但與單純缺氧組之間差異無統計學意義，見圖1、表1。

Figure 1.HE staining for pulmonary artery in rats (HE staining, ×200).

圖1 各組大鼠肺動脈血管的HE染色結果

表1 缺氧及高碳酸血癥大鼠mPAP、RV/(LV+S)及WA/TA指標的變化

Table 1.The changes of mPAP, RV/(LV+S) and WA/TA in hypoxic and hypercapnic rats (Mean±SD.n=8)

GroupmPAP(mmHg)RV/(LV+S)WA/TA(%)Normoxia12．12±2．48 0．256±0．02818．89±4．12Hypoxia24．17±3．93??0．318±0．030??35．85±8．79??Hypercapnia14．48±2．730．266±0．01926．62±5．86?Hypoxia+hypercapnia18．49±3．22##△0．273±0．027##29．97±4．93

*P<0.05,**P<0.01vsnormoxia;##P<0.01vshypoxia;△P<0.05vshypercapnia.

動脈血氣分析顯示，缺氧組大鼠PaO2顯著低于常氧組(P<0.01)；缺氧+高碳酸血癥組PaO2較缺氧組升高(P<0.05)。缺氧組與常氧組之間PaCO2的差異無統計學顯著性；而PaCO2在高碳酸血癥組及缺氧+高碳酸血癥組均顯著高于缺氧組以及常氧對照組(P<0.01)，見表2。

表2 缺氧及高碳酸血癥大鼠動脈血氣指標的變化

**P<0.01vsnormoxia;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia;△P<0.05,△△P<0.01vshypercapnia.

2 大鼠肺組織膠原交聯的變化

高碳酸血癥組交聯的膠原與常氧對照組比較差異無統計學顯著性；缺氧組交聯的膠原則明顯高于常氧對照組(P<0.01)。缺氧+高碳酸血癥組大鼠肺組織的膠原交聯明顯低于缺氧組，見表3。

表3 缺氧及高碳酸血癥大鼠肺組織交聯膠原的變化

Table 3.The effect of hypoxia and/or hypercapnia on collagen cross-linking in the rat lung tissue (Mean±SD.n=8)

GroupCross?linksNormoxia2．55±0．15Hypoxia3．63±0．27??Hypercapnia2．69±0．21Hypoxia+hypercapnia2．98±0．32##△

**P<0.01vsnormoxia;##P<0.01vshypoxia;△P<0.05vshypercapnia.

3 免疫組織化學法檢測大鼠肺動脈LOX蛋白的表達變化

免疫組織化學檢測顯示，常氧對照組及高碳酸血癥組大鼠的肺中小動脈平滑肌、肺泡上皮細胞LOX蛋白呈弱棕黃色免疫反應。缺氧組大鼠肺中小動脈平滑肌、肺泡上皮細胞LOX蛋白免疫反應顯色明顯增強；缺氧+高碳酸血癥組大鼠肺中小動脈、肺泡上皮細胞LOX蛋白的免疫反應顯著弱于缺氧組，見圖2。

4 大鼠肺組織LOX酶活性、mRNA及蛋白水平的變化

缺氧組大鼠肺組織LOX酶活性、mRNA及蛋白水平明顯高于常氧組(P<0.01)。而缺氧+高碳酸血癥組大鼠肺組織LOX酶活性、mRNA及蛋白水平則顯著低于缺氧組(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.Immunohistochemical staining for LOX protein expression in rat lung tissue (light microscopy, ×200)

圖2 各組大鼠肺組織LOX蛋白表達的免疫組化結果

討 論

缺氧合并高碳酸血癥是慢性阻塞性肺疾病及阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的重要病理生理改變，它們共同影響了肺動脈壓力和血管結構重建。Sewing等[5]報道7%濃度高碳酸血癥能下調博來霉素誘導的肺動脈高壓及右心室肥厚。我們研究顯示，單純10%缺氧可促成大鼠肺動脈高壓、右心室肥厚及肺血管壁增厚。盡管與常氧大鼠相似，大鼠暴露于單純7%濃度高碳酸血癥(平均PaCO2≈73.5 mmHg)條件不影響大鼠肺動脈壓力及右心室結構重建。高碳酸血癥能部分阻斷缺氧引起的大鼠肺動脈高壓、右心室肥厚及肺動脈血管壁增厚，與Peng等[6]結果一致。以上提示，一定程度的高碳酸血癥對低氧相關的肺動脈高壓和右心室肥厚具有保護作用。但Zheng 等[7]研究發現高碳酸血癥(8% CO2) 可促進肺動脈收縮，其與本研究結果分歧的原因可能在于：前者的肺動脈實驗環境為92% N2+8% CO2,即氧濃度為0%，而本研究高碳酸血癥實驗條件下的氧濃度卻分別為21%和10%。

Figure 3.LOX activity and expression at mRNA and protein levels in rat lung tissue. A: LOX activity in the lung tissues of the rats； B: the mRNA expression of LOX revealed by real-time PCR; C: the protein expression of LOX determined by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormoxia group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia group;△P<0.05,△△P<0.01vshypercapnia group.

圖3 各組大鼠肺組織LOX酶活性及其mRNA和蛋白水平

肺動脈血管收縮是肺動脈高壓形成的關鍵，膠原的堆積、交聯對肺動脈壓力的維持及惡化起著推進作用[8-9]。本研究顯示缺氧及高碳酸血癥均能增加大鼠肺組織可溶性及不可溶性膠原的含量，但單純缺氧對交聯膠原，即不可溶性膠原/可溶性膠原比值的影響明顯強于單純高碳酸血癥，與Wang等[9]的研究結果一致。正因為缺氧條件下膠原含量尤其是交聯的增加，它增進了肺動脈血管結構重建和僵硬度，更進一步惡化肺動脈高壓。而缺氧與高碳酸血癥共同存在情況下，其交聯的膠原明顯低于單純缺氧，表明高碳酸血癥能通過部分降低缺氧大鼠肺組織膠原交聯的比例，進而削弱缺氧對肺動脈高壓和血管結構重建的影響。

LOX是銅依賴的胺氧化酶，肺血管平滑肌細胞、內皮細胞及成纖維細胞等都能分泌LOX，其催化氧化細胞外基質中去氨基的賴氨酸及羥賴氨酸，是啟動彈性蛋白和膠原蛋白交聯的重要限速酶[10]。通過免疫組織化學顯示，常氧大鼠肺中小動脈平滑肌、肺泡上皮細胞LOX表達均較微弱，而缺氧能明顯促進上述肺組織細胞LOX的表達，實時熒光定量PCR及Western blot實驗驗證了缺氧能上調肺動脈LOX表達。多種可能機制參與了缺氧促進LOX表達的作用。研究顯示，缺氧能通過誘導低氧誘導因子1α、轉移生長因子-β和血小板源性生長因子進而上調LOX表達，是血管平滑肌細胞增殖的關鍵[11-13]。相反，堿性成纖維細胞生長因子和干擾素-γ可下調大鼠主動脈平滑肌細胞LOX表達[14]。缺氧正可能通過上述機制上調LOX表達，由此促進膠原交聯顯著增加，誘使肺動脈高壓的形成和血管結構重建[15]。

單純高碳酸血癥并不改變常氧大鼠的肺動脈LOX表達，但它能抑制因暴露于缺氧條件而增進的LOX表達。Selfridge等[16]研究發現，高碳酸血癥可抑制低氧誘導因子1α蛋白的穩定性及其基因的表達，此可能有助于解釋高碳酸血癥對低氧誘導LOX表達起抑制作用的部分原因。正是基于削弱了缺氧誘導的LOX表達，高碳酸血癥才能在緩解缺氧相關的肺動脈高壓和結構重建的發展中發揮重要作用[6,17]。

總之，缺氧能誘導肺動脈LOX高表達，通過促進膠原合成及其交聯，在肺動脈高壓的形成和發展中發揮重要作用。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effect of hypercapnia on lysyl oxidase-dependent collagen cross-linking and hypoxia-induced pulmonary hypertension in rat

CHEN Wei-qian1, PENG Yan-ping1, ZHANG Wei-xi1, YE Le-ping1, DONG Liang2, XIA Xiao-dong1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospital&YuyingChildren'sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:xia_xiao_dong@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of hypercapnia on hypoxia-induced pulmonary hypertension and the changes of lysyl oxidase (LOX) and extracellular matrix collagen cross-links in the rat. METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups: normoxia group, hypoxia group, hypercapnia group and hypoxia+hypercapnia group. LOX activity was detected by fluorescence spectrophotometry. LOX protein expression was detected by immunohistochemistry and Western blot. The mRNA expression of LOX in the pulmonary artery was detected by real-time PCR. RESULTS: The levels of mean pulmonary artery pressure (mPAP), RV/(LV+S) and WA/TA in hypoxia group were significantly higher than those in normoxia group (P<0.01). Moreover, the levels of mPAP and RV/(LV+S) in hypoxia+hypercapnia group were significantly lower than those in hypoxia group (P<0.01). However, no significant difference of mPAP and RV/(LV+S) between hypercapnia group and normoxia group was observed. In hypoxia group, the collagen cross-links in the lung tissue was significantly higher than that in normoxia group and hypercapnia group (P<0.01). Importantly, collagen cross-links in the lung tissue of hypoxia+hypercapnia group was significantly lower than that in hypoxia group (P<0.01). There was no significant difference in collagen cross-links between hypercapnia group and normoxia group. The expression of LOX at mRNA and protein levels and its activity in the pulmonary arteries of hypoxia group were significantly increased as compared with normoxia group (P<0.01). Furthermore, the expression of LOX at mRNA and protein levels and its activity in the pulmonary arteries in hypoxia+hypercapnia group were lower than those in hypoxia group (P<0.01). CONCLUSION: Hypoxia not only up-regulates LOX but also promotes collagen cross-linking in the rat lung, which contributes to the development of pulmonary hypertension. Hypercapnia inhibits hypoxia-induced LOX expression and collagen cross-linking, therefore impairing the progress in hypoxia-induced pulmonary hypertension.

Hypoxia; Hypercapnia; Pulmonary hypertension; Lysyl oxidase

1000- 4718(2017)08- 1481- 06

2016- 12- 23

2017- 04- 01

浙江省自然科學基金資助項目(No. LY12H01002)；溫州市科技計劃資助項目(No. 2017Y0182)

R562.2； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.022

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