白藜蘆醇通過miRNA-122調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺水平而治療非酒精性脂肪肝

楊慶宇， 郜 娜

(1鄭州人民醫(yī)院藥劑科， 2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450053)

白藜蘆醇通過miRNA-122調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺水平而治療非酒精性脂肪肝

楊慶宇1△， 郜 娜2

(1鄭州人民醫(yī)院藥劑科，2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450053)

目的： 探討白藜蘆醇通過微小RNA(miRNA)-122調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺水平從而治療非酒精性脂肪肝的作用機制。方法：高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠建立非酒精性脂肪肝模型，實驗分為正常對照(control)組、模型(model)組及白藜蘆醇80 mg/kg和160 mg/kg給藥組，給藥4周后檢測血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量，收集肝臟，行HE染色觀察肝臟脂質(zhì)浸潤情況，檢測肝組織神經(jīng)酰胺水平，real-time PCR檢測miRNA-122含量，Western blot檢測肝組織中絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)水平。人肝癌HepG2細胞含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗分為正常對照組、模型(油酸誘導(dǎo))組、模型+白藜蘆醇給藥組、miRNA-122 siRNA組及白藜蘆醇和miRNA-122 siRNA聯(lián)合給藥組，除正常對照組外，各組細胞均同時給予油酸刺激或藥物持續(xù)孵育24 h，檢測細胞勻漿中TC和TG含量、miRNA-122及神經(jīng)酰胺水平，Western blot法檢測各組肝細胞中SPT水平。結(jié)果：白藜蘆醇低、高劑量組均能顯著降低非酒精性脂肪肝小鼠血清TC和TG水平，改善肝組織細胞中脂質(zhì)浸潤情況，減少miRNA-122表達，同時降低肝組織神經(jīng)酰胺水平及SPT蛋白表達。細胞實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，油酸誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積模型組及miRNA-122 siRNA組細胞內(nèi)TC和TG含量均顯著增加，神經(jīng)酰胺及SPT水平亦顯著上升；白藜蘆醇給藥干預(yù)能降低油酸誘導(dǎo)模型組細胞中TC和TG含量、神經(jīng)酰胺水平及SPT蛋白表達；與miRNA-122 siRNA組相比，白藜蘆醇與miRNA-122 siRNA共孵育組TC和TG含量、神經(jīng)酰胺水平及SPT蛋白水平有所降低，但作用有限。結(jié)論：白藜蘆醇能夠顯著減少整體及細胞水平非酒精性脂肪肝模型肝細胞中脂質(zhì)堆積，其機制可能是白藜蘆醇通過上調(diào)miRNA-122水平、下調(diào)SPT蛋白水平而減少肝細胞中神經(jīng)酰胺水平，從而達到治療非酒精性脂肪肝的作用。

白藜蘆醇； 非酒精性脂肪肝； 微小RNA-122； 神經(jīng)酰胺； 絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種慢性損害性肝病，主要特征是肝臟脂質(zhì)沉積達到肝臟總重的5%以上，可由單純性脂肪肝進一步發(fā)展到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)甚至肝硬化、肝癌。NAFLD這一疾病在過去的15年里迅速增長，西方發(fā)達國家的發(fā)病率高達20%～40%，亞洲國家的發(fā)病率為9%～40%[1]。同時，NAFLD亦可促進高血脂和冠狀動脈疾病的發(fā)生和發(fā)展[2]。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)高脂肪飼料喂養(yǎng)大鼠的肝內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯增加，提示肝細胞脂質(zhì)沉積與神經(jīng)酰胺的生成可能存在一定的關(guān)系[3]。胡楊等[4]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺參與了NAFLD大鼠肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積過程，抑制神經(jīng)酰胺的合成則有助于減輕肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約19～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，對動物、植物及人類生理活動具有重要的調(diào)節(jié)作用。在肝細胞中最豐富的miRNA是miRNA-122。大量研究表明，miRNA-122在肝細胞生長、脂質(zhì)代謝及病毒感染等多種生物學(xué)過程方面起調(diào)控作用，其中miRNA-122與脂肪性肝炎的相關(guān)性近年來也得到了重視。在反義寡聚核苷酸阻斷miRNA-122表達的實驗中證實了miRNA-122 在脂肪和膽固醇代謝中的活性[5-6].

白藜蘆醇(resveratrol，RES)已被證實可降低高蔗糖飼喂的NAFLD大鼠血脂和肝臟脂肪，增加機體抗氧化作用[7]，同時可以改善胰島素抵抗，降低糖尿病小鼠血糖和血脂。本研究采用整體和細胞實驗研究白藜蘆醇是否通過調(diào)節(jié)肝組織miRNA-122，進而影響肝組織神經(jīng)酰胺水平，最終減少肝臟脂質(zhì)沉積。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、細胞、試劑和儀器

40只C57BL/6J小鼠，4周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[合格證編號為SCXK(京)2012-0001]，體重18～22 g;高脂高膽固醇飼料購自Research Diet，貨號D12336，其中碳水化合物46%，脂肪16%，膽固醇1.25%；HepG2細胞系購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

白藜蘆醇購自Sigma； C16、C17、C18和 C24神經(jīng)酰胺標準品購自 Avanti；RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清和0.25%胰蛋白酶購自Gibco；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Beyotime；抗絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyltransferase，SPT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自Abcam；miRNA-122 siRNA購自上海吉瑪生物股份有限公司；RT-qPCR試劑盒購自TaKaRa;總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

低溫超速離心機及酶標儀(Thermo)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；分析天平及電子秤(METTLER TOLEDO)；細胞培養(yǎng)箱(SANYO)；蛋白印跡電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；超凈工作臺(SIEMENS)；流式細胞儀(Beckman Coulter)。液相色譜條件：分析柱 Zorbax SB C8(2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm)；柱溫 35 ℃；流動相為甲醇和2 mmol/L醋酸銨(0.1% 甲酸)。質(zhì)譜條件：ESI 離子源，負離子模式。離子源參數(shù)如下：氣體溫度325 ℃；氣體流速 5 L/min；霧化器壓力 45 Psi；鞘氣溫度 350 ℃；鞘氣流速 11 L/min；毛細管電壓 3 500 V (+)。

2 方法

2.1 動物造模、分組及給藥 所有40只小鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，溫度25 ℃，濕度55%～65%，維持12/12 h明暗交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取30只小鼠給予高脂高膽固醇飼料飼喂建立非酒精性脂肪肝模型，4周后根據(jù)血脂水平分為3組，每組10只：模型(model)組給予等量溶媒；白藜蘆醇低、高劑量(low-dose and high-dose RES, RES-L and RES-H)組分別給予80 mg/kg和160 mg/kg白藜蘆醇溶液。另10只小鼠始終飼喂正常飼料，并給予等量溶媒。持續(xù)給藥4周后，眼底靜脈竇采血，3 500 r/min離心15 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分離肝臟，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

2.2 生化指標的測定 分組給藥前和實驗終點時，各組小鼠禁食不禁水12 h，眼底靜脈竇采血，分離血清，根據(jù)試劑盒方法檢測血清中TC和TG含量。

2.3 HE染色 將固定于10%甲醛溶液中的肝組織脫水后常規(guī)石蠟包埋、切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，伊紅染色，蘇木精復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片，光鏡下觀察，進行病理學(xué)分析。

2.4 Real-time PCR 檢測肝組織中miRNA-122水平 采用Trizol兩步法抽提小鼠肝組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作。20 μL反應(yīng)體系如下：total RNA 50 ng～5 μg， 2×TS Reaction Mix 10 μL， GSP(RT-Primer) 2 μL (1 pmol)， Transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL， 加RNase-free water 至20 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min， 85 ℃ 5 min。所得cDNA于-20 ℃中保存待用。

采用real-time PCR 檢測小鼠肝組織中 miRNA-122含量，以U6作為內(nèi)參照。 miRNA-122 的上游引物序列為5’-CCAAACACCATTGTCACACTCCAG-3’， 下游引物序列為5’-CTAGCTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGGAGCT-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’。反應(yīng)體系(20 μL)如下：RT-Product 2 μL， SYBR Green Mix 9 μL， ddH2O 7.4 μL， 正義引物0.8 μL (200 nmol/L)， 反義引物0.8 μL (200 nmol/L)。計算公式為2-ΔΔCt。

2.5 細胞培養(yǎng)及分組 HepG2細胞采用含 100 mg/L鏈霉素和100 kU/L 青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基加10%小牛血清培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液，待細胞生長至對數(shù)生長期后進行實驗，實驗分為正常對照(control)組、油酸(0.25 mmol/L)誘導(dǎo)模型(model)組、油酸誘導(dǎo)模型給予5 μmol/L白藜蘆醇給藥(model+RES)組、miRNA-122 siRNA組及miRNA-122 siRNA與白藜蘆醇共孵育(miRNA-122 siRNA+RES)組，各組刺激及給藥處理同時進行，持續(xù)12 h。

2.6 miRNA-122 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測 將對數(shù)期的HepG2細胞接種于6孔板中，采用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明，采用瞬時轉(zhuǎn)染法將1 μg miRNA-122 siRNA和陰性對照轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中，6 h后去除轉(zhuǎn)染試劑，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

2.7 脂質(zhì)含量的測定 稱取200 mg左右肝臟組織并記錄重量或取6孔板培養(yǎng)細胞，加2 mL氯仿/甲醇(2∶1)混合液，使用勻漿機充分分散。3 500 r/min離心10 min。將上清相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并加0.2倍體積的生理鹽水，渦旋10 min。3 500 r/min離心5 min，靜置分層。分離下層含油脂的液相，充分揮干。用1 mL異丙醇溶解油脂。用試劑盒測定溶液中TC、TG的濃度，并根據(jù)稱取的組織重量計算肝臟TC和TG含量。

2.8 神經(jīng)酰胺含量的測定 采用胡楊等[4]方法進行檢測。將2 mL 甲醇分別加入C16、C17、C18 和C24 神經(jīng)酰胺標準品中，振蕩混勻后使其徹底溶解，置于-20 ℃冰箱備用，使用時根據(jù)不同的濃度稀釋。各個不同濃度的神經(jīng)酰胺標準品溶液進樣，并繪制各個神經(jīng)酰胺的標準曲線，計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

稱量50 mg濕潤肝組織或取6孔板培養(yǎng)細胞于EP 管中，加1 mL 氯仿和甲醇(2∶1)的混合液，用BCA 法測定蛋白濃度；然后加入1 μg C17神經(jīng)酰胺標準品作為內(nèi)參照；收集下層氯仿層，冷凍干燥后加入1 mL 甲醇，渦旋震蕩混勻后置于-20 ℃冰箱保存待測。檢測時先設(shè)定液相色譜條件和質(zhì)譜條件，然后將不同組別的脂類提取1.5 μL 進樣，記錄色譜圖的峰值起止時間、保留時間、峰值面積、峰值高度等數(shù)據(jù)。最后按照線性回歸方程計算出不同實驗組肝組織內(nèi)的神經(jīng)酰胺含量。

2.9 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 提取肝組織和細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒測定樣品蛋白含量，配制5%濃縮膠和15%分離膠，上樣，電泳，之后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉封閉液中室溫下封閉2 h，洗膜，加抗SPT抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加 II 抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件對結(jié)果進行處理分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇對各組小鼠血脂水平的影響

與control組相比較，model組TC及TG水平均顯著增加；與model組相比，白藜蘆醇80 mg/kg和160 mg/kg均可顯著降低高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型小鼠血清TC和TG的水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見圖1。

Figure 1.The serum levels of TC and TG in each group after 4-week treatment with RES at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖1 灌胃給予白藜蘆醇4周后各組小鼠血清TC和TG水平的變化

2 白藜蘆醇對小鼠肝組織脂肪含量的影響

各組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)檢查如圖2A所示，正常對照組肝臟組織形態(tài)學(xué)正常，結(jié)構(gòu)完整，細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝小葉輪廓清晰，肝細胞呈多邊形，細胞分界清，核圓而清晰，位于細胞中央；model組肝細胞索紊亂，肝細胞腫脹呈氣球樣變，胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等、數(shù)量不一的脂肪空泡和水樣變性；白藜蘆醇低、高劑量組均可見肝組織脂肪沉積減少，高劑量組脂肪沉積顯著少于低劑量組。

由圖2B、C可以看出，小鼠經(jīng)高脂高膽固醇飼喂誘導(dǎo)建模后，肝組織TC及TG含量均顯著升高，而白藜蘆醇可劑量依賴性地降低模型小鼠肝組織中TC及TG含量，與肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果一致。

Figure 2.The histopathological examination of liver (A； HE staining，×200), and liver content of TC (B) and TG (C) in each group after 4-week treatment with RES at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 灌胃給予白藜蘆醇4周后各組小鼠肝組織病理學(xué)檢查及肝組織TC和TG含量的變化

3 白藜蘆醇對小鼠肝組織神經(jīng)酰胺水平的影響

根據(jù)胡楊等[4]報道顯示，本實驗中主要檢測C16:0及C24:0神經(jīng)酰胺水平。與正常對照組相比，模型組小鼠經(jīng)高脂高膽固醇飼料飼喂誘導(dǎo)后肝組織2種神經(jīng)酰胺水平顯著升高;與模型組相比，給藥干預(yù)4周后，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝組織2種神經(jīng)酰胺水平均顯著降低，并呈一定劑量依賴性，見圖3。

Figure 3.The liver C16:0 and C24:0 ceramide content in each group after 4-week treatment with RES at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 灌胃給予白藜蘆醇4周后各組小鼠肝組織C16:0和C24:0神經(jīng)酰胺含量的變化

4 白藜蘆醇對小鼠肝組織SPT蛋白水平的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織SPT蛋白水平顯著上調(diào);與模型組相比，白藜蘆醇低、高劑量組模型小鼠經(jīng)灌胃干預(yù)4周后，肝組織SPT蛋白水平顯著增加，并呈一定劑量依賴性，見圖4。

Figure 4.The relative liver protein level of SPT in each group after 4-week treatment with RES at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 灌胃給予白藜蘆醇4周后各組小鼠肝組織SPT蛋白水平的變化

5 白藜蘆醇對小鼠肝組織miRNA-122水平的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織miRNA-122的表達水平顯著降低;與模型組相比，灌胃分別給予非酒精性脂肪肝小鼠白藜蘆醇80 mg/kg和160 mg/kg 4周可顯著上調(diào)模型小鼠肝組織中miRNA-122的表達水平，且給藥組呈現(xiàn)一定劑量依賴性，見圖5。

6 HepG2細胞中miRNA-122 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測

采用瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miRNA-122 siRNA于HepG2細胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察miRNA-122 siRNA的轉(zhuǎn)染效率，約有60%以上的細胞表達綠色熒光蛋白。與此同時，real-time PCR實驗結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染miRNA-122 siRNA 24 h后， 細胞中miRNA-122 siRNA的表達明顯增加，說明可用于后續(xù)實驗，見圖6。

Figure 5.The relative liver miRNA-122 levels in each group after 4-week treatment with RES at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 灌胃給予白藜蘆醇4周后各組小鼠肝組織miRNA-122表達水平的變化

Figure 6.The efficiency of miRNA-122 siRNA transfection in HepG2 cells observed by fluorescence microscence (A， B) and detected by real-time PCR (C). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

圖6 HepG2細胞中miRNA-122 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測

7 白藜蘆醇對HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響

細胞實驗中，除正常對照組之外，刺激(油酸或miRNA-122 siRNA)或給藥干預(yù)(白藜蘆醇)均單獨或共同孵育24 h。由結(jié)果可以看出，與正常對照組相比，模型組HepG2細胞經(jīng)油酸刺激24 h后，細胞中TC和TG含量顯著增加；與模型組相比，白藜蘆醇給藥組細胞中TC及TG含量顯著降低，與小鼠實驗結(jié)果一致；miRNA-122 siRNA組細胞中TC及TG含量顯著高于正常對照組，但低于模型組；miRNA-122 siRNA和白藜蘆醇聯(lián)合給藥組與miRNA-122 siRNA單獨給藥組相比，略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖7。

Figure 7.TC (A) and TG (B) levels in the HepG2 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel (OA) group.

圖7 各組HepG2細胞中TC和TG含量的變化

8 白藜蘆醇對HepG2細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量的影響

與正常對照組相比，模型組HepG2細胞經(jīng)油酸刺激24 h后，細胞中神經(jīng)酰胺含量顯著增加；與模型組相比，白藜蘆醇給藥組細胞中神經(jīng)酰胺含量顯著降低；miRNA-122 siRNA給藥組細胞中神經(jīng)酰胺含量顯著高于正常對照組，但低于油酸誘導(dǎo)模型組；與miRNA-122 siRNA單獨給藥組相比，miRNA-122 si-RNA和白藜蘆醇聯(lián)合給藥組細胞中神經(jīng)酰胺含量有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖8。

Figure 8.C16：0 (A) and C24：0 (B) ceramide levels in the HepG2 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel (OA) group.

圖8 各組HepG2細胞中C16：0和C24：0神經(jīng)酰胺含量的變化

9 白藜蘆醇對HepG2細胞內(nèi)SPT蛋白水平的影響

與正常對照組相比，模型組HepG2細胞經(jīng)油酸刺激24 h后，細胞中SPT表達水平顯著上調(diào)；與模型組相比，白藜蘆醇給藥組細胞中SPT水平顯著降低；miRNA-122 siRNA給藥組細胞中SPT蛋白水平含量顯著高于正常對照組，但低于油酸誘導(dǎo)模型組；與miRNA-122 siRNA單獨給藥組相比，miRNA-122 siRNA和白藜蘆醇聯(lián)合給藥組細胞中SPT蛋白水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖9。

Figure 9.The relative protein levels of SPT in the HepG2 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel (OA) group.

圖9 各組HepG2細胞中SPT蛋白水平

討 論

神經(jīng)酰胺是細胞膜的組成成分，主要由長鏈脂肪酸和鞘氨醇組成。此外，神經(jīng)酰胺作為第二信使參與細胞增殖、分化和凋亡等生命活動，發(fā)揮著重要的生理學(xué)作用。近來大量研究表明，神經(jīng)酰胺對NAFLD的形成和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。Chocian等[8]采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD模型，發(fā)現(xiàn)其肝細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯增加；而采用多球殼菌素阻斷神經(jīng)酰胺的從頭合成途徑， 能減輕高脂喂養(yǎng)小鼠肝內(nèi)的脂肪沉積[9]。機體神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的途徑主要有從頭合成途徑、 鞘磷脂循環(huán)途徑和鞘氨醇合成途徑3種。 從頭合成途徑是神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的主要途徑，該途徑主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體中，絲氨酸與棕櫚酰CoA在SPT 催化下形成3-酮-二氫鞘氨醇，再依次轉(zhuǎn)化為二氫鞘氨醇、二氫神經(jīng)酰胺，最后形成神經(jīng)酰胺，其中SPT是從頭合成途徑的限速酶[10-11]。本研究在NAFLD小鼠模型及肝細胞脂質(zhì)沉積模型上均可見神經(jīng)酰胺及其從頭合成途徑關(guān)鍵酶SPT顯著升高，而給予白藜蘆醇可呈劑量依賴性地降低神經(jīng)酰胺和SPT水平，可見白藜蘆醇對NAFLD的治療作用可能部分是通過對神經(jīng)酰胺的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。

miRNA-122是在脊椎動物肝組織中表達豐富且高度保守的miRNA，可見其對肝臟的重要作用。miRNA-122由22個核苷酸組成，通過調(diào)節(jié)多種不同肝功能涉及到的相關(guān)靶mRNA，起到維持肝臟穩(wěn)態(tài)的作用。 通過藥理學(xué)和遺傳學(xué)手段抑制miRNA-122可以導(dǎo)致全身和肝臟脂質(zhì)代謝、鐵穩(wěn)態(tài)及肝細胞分化的紊亂[12]。臨床研究表明，在早期NASH患者中，miRNA-122水平顯著下調(diào)，這些患者在采取上調(diào)miRNA-122治療措施后肝臟功能得到恢復(fù)，肝臟脂質(zhì)沉積、炎癥及纖維化程度顯著降低，該結(jié)果在miRNA-122基因敲除小鼠模型上也得到證實。本實驗中，采用高脂高膽固醇飲食建立的NAFLD模型小鼠可見肝組織miRNA-122水平顯著降低，而神經(jīng)酰胺及SPT水平顯著升高，同時模型小鼠肝組織脂質(zhì)大量沉積，而給予白藜蘆醇治療后，肝組織脂質(zhì)沉積顯著減少，同時伴隨肝組織miRNA水平升高、神經(jīng)酰胺及SPT表達水平的降低，因此我們推測白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)miRNA-122和神經(jīng)酰胺水平達到治療NAFLD作用的。本實驗通過細胞實驗進一步驗證我們的假說，在油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂質(zhì)沉積模型中，與動物模型結(jié)果一致，miRNA-122水平顯著下降，伴隨神經(jīng)酰胺水平升高；同時miRNA-122 siRNA組細胞脂質(zhì)含量亦高于正常對照組，且伴隨神經(jīng)酰胺及SPT上調(diào)；與該組相比miRNA-122 siRNA聯(lián)合白藜蘆醇共同培養(yǎng)組脂質(zhì)含量、神經(jīng)酰胺水平及SPT表達均顯著降低。

綜上所述，本實驗從整體及細胞水平均證實白藜蘆醇可通過上調(diào)miRNA-122水平，進而抑制SPT，降低神經(jīng)酰胺水平，達到改善肝組織脂質(zhì)沉積、治療NAFLD的作用。

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(責(zé)任編輯： 林白霜, 羅 森)

p53通過誘導(dǎo)miR199a-3p抑制SOCS7，從而抑制UUO中的STAT3活化和腎纖維化

近來p53在腎纖維化中的作用被研究較多，但其功能仍然存在爭議，其潛在的機制尚不清楚。Yang等的研究顯示，在藥理學(xué)和基因上阻斷p53可減輕單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethral obstruction, UUO)小鼠的腎間質(zhì)性纖維化、凋亡和炎癥。有趣的是，p53的阻斷與miR-215-5p、miR-199a-5p&3p 和STAT3的抑制有關(guān)。在培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞(HK-2)中，TGF-β1處理導(dǎo)致纖維化改變，包括膠原蛋白I(collagen I)和波形蛋白(vimentin)表達，且與p53積聚、p53 Ser15磷酸化和miR-199a-3p表達相關(guān)。用pifithrin-α阻斷p53可抑制TGF-β1處理過程中STAT3的活化及miR-199a-3p、膠原蛋白I和波形蛋白的表達。過表達miR-199a-3p可增加TGF-β1誘導(dǎo)的膠原蛋白I和波形蛋白表達，并恢復(fù)SOCS7表達。此外，SOCS7被鑒定為miR-199a-3p的一個靶基因，并且SOCS7沉默可促進STAT3活化。ChIP分析表明，p53可與miR-199a-3p的啟動子區(qū)域結(jié)合。來自IgA腎病和糖尿病腎病患者的腎活檢標本顯示，p53和STAT3均明顯活化，SOCS7表達減少，促纖維化蛋白和miR-199a-3p表達增加。這些結(jié)果一起證明了腎間質(zhì)纖維化中存在一條新的p53/miR-199a-3p/SOCS7/STAT3通路。

Sci Rep, 2017, 7:43409(李肖肖)

Effects of resveratrol on levels of ceramide via regulating miRNA-122 in treating non-alcoholic fatty liver disease

YANG Qing-yu1, GAO Na2

(1DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,2DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity&HenanCancerHospital,Zhengzhou450053,China.E-mail:yangqingyude@126.com)

AIM: To observe the therapeutical effects of resveratrol on non-alcoholic fatty liver disease and its potential mechanism. METHODS: Male C57BL/6J mice were fed with high-fat and high-cholesterol diet to established non alcoholic fatty liver disease model, and were administrated with resveratrol at doses of 80 mg/kg and 160 mg/kg. After 4-week treatment, the blood sample was collected for determination of total cholesterol (TC) and triglyceride (TG). The liver tissues were harvested for measuring the liver lipid content. The histopathological examination were conducted with hematoxylin and eosin staining. The ceramide levels in the liver tissues were detected by HPLC-MS. The microRNA (mi-RNA)-122 levels in the liver tissues were detected by real-time PCR. The protein levels of serine palmitoyltransferase (SPT) were determined by Western blot. The HepG2 cells were cultured and divided into 5 groups: control group, model group (induced by 0.25 mmol/L oleic acid), model+resveratrol group (treated with 5 μmol/L resveratrol), miRNA-122 siRNA group and resveratrol+miRNA-122 siRNA group. Except control group, the cells in other groups were stimulated with oleic acid and incubated with respective drugs simultaneously for 24 h. The levels of TC, TG and ceramide in the cells of each group were measured. The protein levels of SPT in each group were determined by Western blot. RESULTS: In non-alcoholic fatty liver disease mice, resveratrol dose-dependently reduced the serum TC and TG levels, decreased the lipid deposition, the ceramide level and the SPT protein level, and increased the level of miRNA-122 in the liver tissues. In theinvitrostudy, compared with model group, resveratrol reduced the serum TC and TG levels, decreased the ceramide level, reduced the SPT protein level. Compared with control group, the levels of TC, TG and ceramide， and the protein expression of SPT were increased in miRNA-122 siRNA group. Compared with miRNA-122 siRNA group, no statistical difference of TC, TG, ceramide and protein expression of SPT in resveratrol combined miRNA-122 siRNA group was observed. CONCLUSION: Resveratrol significantly reduces lipid accumulation by reduction of miRNA-122 and ceramide levels, and decrease in SPT protein levels in the liver.

Resveratrol; Non-alcoholic fatty liver disease; MicroRNA-122; Ceramide; Serine palmitoyltransferase

1000- 4718(2017)08- 1506- 08

2017- 04- 10

2017- 07- 07

R965;R575.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.026

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