mt01對人牙周膜細胞中成骨細胞相關因子mRNA表達的影響

張松濤，趙西珍，高 黎

(1.三門峽口腔醫院，河南 三門峽472000；2.三門峽市中心醫院口腔科，河南 三門峽472000；3.鄭州大學口腔醫學院 兒童口腔科，河南鄭州450052)

*通訊作者

mt01對人牙周膜細胞中成骨細胞相關因子mRNA表達的影響

張松濤1，趙西珍2，高 黎3*

(1.三門峽口腔醫院，河南 三門峽472000；2.三門峽市中心醫院口腔科，河南 三門峽472000；3.鄭州大學口腔醫學院 兒童口腔科，河南鄭州450052)

臨床上很多牙病治療需要借助牙齒的再生功能才能達到治療的目的，如口腔正畸，通過外力將牙齒移動位置后原有的牙齒發生了位移，其原有的牙骨受到破壞，需要在新位置上的牙周膜細胞重新生成牙骨，通過這種破骨-成骨過程達到實現骨改建的目的[1,2]。在此過程中，牙周膜細胞中成骨分化是實現牙槽骨改建最重要的步驟[3,4]。臨床上很多患者不具備較強的牙周膜細胞成骨分化能力，使正畸的效果受到影響，或者臨床為了加快正畸完成時間，需要通過一定的手段促進牙周膜細胞成骨分化速度。目前，正畸成為大部分家庭兒童或成年人的牙保健選擇，因此，需要正畸的人群數量龐大，而大多數正畸完成的時間在1.5-2年，對患者的工作、學習造成嚴重影響[5,6]。因此，尋找可以促進牙周膜細胞成骨分化的方案已成為臨床研究的熱點。基于此，在充分研究目前促進牙周膜細胞成骨分化臨床文獻的基礎上，我們選擇寡核苷酸mt01作為促進人牙周膜細胞成骨分化的切入點，分析不同濃度的寡核苷酸mt01對人牙周膜細胞成骨分化的影響，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2015年1月-2016年1月在三門峽口腔醫院行牙齒正畸時拔除的健康牙齒作為研究對象。

1.2 儀器與試劑

ODN mt01(大 連 寶 生 物 公 司)；CO2恒溫培養箱(美國NAPCO公司生產)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司生產)胰蛋白酶(美國Sigma公司生產)；磷酸鹽緩沖液(自制)；超凈工作臺(蘇州凈化有限公司生產)；恒溫水浴箱(常州實驗儀器有限公司生產)；離心機(常州實驗儀器有限公司生產)；原位雜交儀(杭州瑞成儀器有限公司生產，型號：SH2000)，4塊板加熱振蕩器(杭州瑞成儀器有限公司生產，型號：TS300)。寡核苷酸探針：安必奇生物科技有限提供。

1.3 方法

按照人牙周膜細胞離體培養、寡核苷酸混合培養和原位雜交技術測定的步驟完成實驗過程。具體方法如下。

1.3.1 人牙周膜細胞離體培養 刮取健康牙齒牙周膜進行雙抗處理，置于消化液中，于4℃冰箱中消化處理16 h，顯微鏡下夾取分離上層表層細胞，置于胰蛋白酶中，于37℃恒溫水浴箱中消化15 min，然后吹打呈單細胞懸液，離心加入培養液，調整細胞濃度越為500×103個/ml，接種培養值細胞張曼培養皿，進行后續傳代培養，連續培養三代。收集第三代培養細胞備用。

1.3.2 寡核苷酸mt01+人牙周膜細胞混合培養 取生長良好的三代人牙周膜細胞，按照每孔鋪5×103個細胞分別接種于96孔板中的50個樣品孔中進行培養，待細胞貼壁后，分別向孔內加入不同濃度(1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L)的寡核苷酸mt01溶液和對照PBS各10份，繼續培養96 h。采用原位雜交技術檢查添加不同濃度寡核苷酸mt01的人牙周膜細胞中ALP、BGPmRNA表達結果差異，以細胞染色程度判定ALP和OCNmRNA陽性表達率。

1.3.3 原位雜交技術測定人牙周膜細胞中ALP、OCNmRNA表達 將商購的寡核苷酸探針采用3’-尾端標記法行DIG標記寡核苷酸探針。采用磷酸緩沖液(PBS)對培養得到的人牙周膜細胞逐份洗滌3次，分別采用稀鹽酸溶液室溫處理10 min，再經PBS洗滌3次，向細胞懸液中滴加蛋白酶K溶液，于37℃水域中培養8 min，加入PBS洗滌、過濾3次，經洗滌的細胞采用多聚甲醛處理固定，室溫放置10 min后，PBS洗滌2次，加入乙醇脫水15 s；向每管細胞懸液中加入雜交液(配制方法:HybA液18 μl，HybB液2 μl，混合后，80C加熱10 min，離心15 s),加塞密封，置于42C攝氏度水浴箱中保溫20 h，去掉管塞，向試管里加入甲酰胺×SSC，于37℃水浴箱中洗滌30 min，2×SSC，于37℃水浴箱中洗滌15 min 0.1×SSC，37℃水浴箱中洗滌5 s，BufferI洗5 s×1次；加入馬血清封閉頁面，室溫放置50 min，向試管內加入抗Dig-AP50 μl，37℃水浴箱中放置60 min；Buffer溶液洗滌3次，每次15 min，Buffer溶液洗滌3次，每次洗滌1 min；加入NBT/BCIP顯色/核固紅復染。放置5 min后，取溶液于顯微鏡下觀察細胞漿內顏色變化。

1.4 結果判定

ALPmRNA陽性表達判定：在細胞胞漿內若有彌散分布的細紗樣的藍紫色點狀顆粒，判定為+；顆粒染色加深，顆粒變大，記錄為++；+和++樣品份數之和/總份數×100%，為ALP陽性表達率。

OCN mRNA陽性表達判定：細胞內出現細小的藍紫色顆粒，表明有OCN的轉錄表達，記錄為+；顆粒變大，顏色加深，判定為++；陽性率計算同ALPmRNA表達陽性率。

1.5 統計學處理

對研究所得數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料行t檢驗，計數資料行卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細胞ALPmRNA表達比較

不同濃度寡核苷酸mt01培養人牙周膜細胞中ALPmRNA表達陽性率均明顯高于PBS對照組，差異有統計學意義(P<0.05),2 mg/L濃度寡核苷酸mt01培養人牙周膜細胞中ALPmRNA表達陽性率明顯高于濃度1 mg/L、3 mg/L、4 mg/L濃度寡核苷酸mt01，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細胞ALPmRNA表達比較

注：*與對照組比較，P<0.05，#與2 mg/L比較，P<0.05。

2.2 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細胞OCN mRNA表達比較

不同濃度寡核苷酸mt01培養人牙周膜細胞中OCNmRNA表達陽性率均明顯高于PBS對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；2 mg/L濃度寡核苷酸mt01培養人牙周膜細胞中OCNmRNA表達陽性率明顯高于濃度1mg/L、3 mg/L、4 mg/L濃度寡核苷酸mt01，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度寡核苷酸mt01對人牙周膜細胞OCN mRNA表達比較

注：*與對照組比較，P<0.05，#與2 mg/L比較，P<0.05。

3 討論

近年關于骨的新陳代謝研究發現，骨是一種新型的內分泌器官，骨在合成過程中分泌兩種激素，即成纖維細胞因子23 和骨鈣素 (OCN)[7,8]。這兩種激素對體內磷和能代謝具有較強的調節作用，在骨的生長代謝中發揮重要作用。其中成骨細胞產生的OCN釋放到血液中后，分布到全身多種器官和組織，發揮對胰島素β細胞、脂肪細胞等的調節作用，而胰島素β細胞和脂肪細胞反饋至骨，則促進骨鈣素的活化，增強了骨的新成代謝，促進骨的重建[9,10]。骨細胞和成骨細胞是產生OCN的主要部位，以羧化無活性形式儲存于骨胞外基質中，破骨細胞在骨表面產生的酸度適宜時，OCN 脫羧化成為uc OCN 活性形式，促進β胰島細胞分泌胰島素。因此，骨鈣素能反映相關器官、組織及細胞的骨重建的過程[11,12]。

堿性磷酸酶是成骨細胞分泌的胞外酶，其在骨組織形成、代謝、再生過程中發揮重要作用，是臨床判斷成骨細胞分化情況的重要標志物。目前ALP 被臨床普遍認可為細胞成骨向分化的靈敏標志物，是評價細胞成骨向分化可靠指標。

臨床實驗室研究顯示，特定序列的寡核苷酸對成骨-破骨平衡系統具有調節作用[13,14]。目前篩選出的對大鼠骨髓間充質干細胞和人源性成骨樣細胞系MG63細胞生物學特性有影響作用的特定序列寡核苷酸mt01。人牙周膜是具有多向分化潛能的細胞，在牙齒的重建過程中發揮重要作用[15]。

基于上述研究，本研究通過寡核苷酸mt01作用于人牙周膜細胞后，對其骨鈣素和堿性磷酸酶mRNA表達情況進行分析，以明確寡核苷酸mt01是否能促進人牙周膜細胞成骨分化作用。結果顯示，經寡核苷酸mt01作用后的人牙周膜細胞中ALPmRNA表達陽性率、OCNmRNA表達陽性率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明寡核苷酸mt01具有促進人牙周膜細胞中成骨細胞相關因子mRNA表達的作用，其中以濃度水平為2 mg/L的寡核苷酸mt01促進ALP和OCNmRNA的陽性率效果最好。這為臨床牙重建相關的治療過程促進牙骨重建藥物制劑研究提供了新的方向，有望提高牙重建相關治療的質量和水平。

綜上所述，寡核苷酸mt01可促進人牙周膜細胞中成骨細胞相關因子ALP和OCNmRNA表達，因此寡核苷酸類制劑具有促進人牙周細胞成骨向的作用，可作為人牙相關疾病治療的輔助藥物，促進人牙周成骨分化，降低人牙周膜細胞成骨分化的時間，提高治療質量，提高正畸等牙病治療的適應癥，具有較高的臨床價值。

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1007-4287(2017)08-1430-03

2016-07-23)