補腎活血中藥促成骨增殖靶效應抗骨質疏松的機制研究

林松青，王 彬，周 潔，陳 宇，范世珍

(1.廣州中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳518000；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410000)

補腎活血中藥促成骨增殖靶效應抗骨質疏松的機制研究

林松青1，王 彬1，周 潔2，陳 宇1，范世珍1

(1.廣州中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳518000；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410000)

骨質疏松癥(OP)是臨床中常常遇見的骨疾病,是引起全身骨量降低的主要因素,進而導致骨微結構毀壞以及骨密度降低,增加骨脆性因而易于發生骨折[1]，嚴重者甚至威脅生命。目前西醫臨床用于治療骨質疏松癥的藥物主要有雌激素、降鈣素以及阿倫磷酸鹽等藥物，其臨床療效尚可，但副作用也多。研究表明[2]，人們隨著年齡的增加，胃腸道、肝腎功能也隨之衰退，老年人長期用藥后容易導致藥物在體內蓄積，副作用明顯增大，且對治療骨質疏松的療效明顯降低。中醫治療骨質疏松癥主要從“腎主骨”論治，輔以活血，能夠明顯的緩解骨質疏松患者的臨床癥狀及生活質量的提高。研究表明，補腎活血中藥通過加快成骨細胞的增殖分化進而增快骨形成，但中藥促進成骨，抑制骨吸收的效應與機制尚不完全清楚，研究發現NF-κB信號通路是其作用的重要靶點。NF-κB信號通路在成骨細胞分化、增殖及凋亡中有著關鍵的作用，同時還能介導骨組織的生長發育。本實驗通過體外實驗來分析NF-κB信號通路在補腎活血中藥抑制骨吸收、促進骨形成過程中的作用機制，探討NF-κB信號通路相關基因成骨分化的分子功能，從細胞分子學角度分析補腎活血中藥防治骨質疏松癥的科學依據及作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 補腎活血方(主要成分為補骨脂、熟地、黃芪、山茱萸、當歸)的提取藥物，最后提煉制成中藥凍干粉(康美藥業公司提供)。成骨細胞由SD大鼠頭蓋骨分離培養；破骨細胞由四肢骨分離培養。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞的分離與培養 取一日齡SD大鼠麻醉下處死,以75%酒精浸泡15 min,取出頭蓋骨,以DMEM洗凈、剪為1立方毫米大小的骨塊,接著將附著軟組織剔凈,獲取其細胞,再用PBS緩沖液沖洗,放于NCS-MEM培養液中培養,培養液濃度為10%。接著靜置培養于37℃ 5%CO2中,時間間隔2天換1次培養液,棄去原培養液,然后于胎牛血清MEM中開始培育,培養液濃度為10%。直到單層細胞鋪滿培養瓶底,時間通常為4-7天。觀察到細胞開始傳代時,先把原培養液倒掉,然后選用D-Hank’s液對培養的細胞進行沖刷,消化選用0.25%胰蛋白酶,倒掉消化液后再倒入培養液,接著對培養瓶底進行吹打,促使細胞脫落,從而制成細胞懸液,最后接種于新的培養瓶,放置于37℃、5%CO2中靜置繼續培育。

1.2.2 破骨細胞的分離與培養 麻醉下取SD大鼠的四肢長骨,然后沖洗大鼠骨髓,過80目篩，移于試管中，加培養液混勻，取下2/3的培養液，用10%牛血清培養液培養，3 h后更換培養液， 2 d后再次更換培養液，持續培養。

1.2.3 成骨細胞-破骨細胞共育體系的創設 先對破骨細胞進行細胞計數,再對成骨細胞計數,用培養液調整成骨細胞數,使成骨細胞和破骨細胞數目之比為10∶1、100∶1,將其種植于24孔板中,用含有1mM的B-甘油磷酸鈉培養細胞6h后,取成功培育的破骨細胞和成骨細胞進行貼面培養,收集成骨細胞,對細胞堿性磷酸酶的含量及活性進行檢測并對細胞堿性磷酸酶染色。。

1.2.4 藥物制備 用煎煮法以水為溶劑提取中藥配方的有用成分，最后得到藥材重量：中藥水提液=1∶1～1∶1.5，冷卻后，往水提液中一邊放入無水乙醇一邊攪拌至乙醇濃度為 50%-60%，靜置6 h。抽濾，棄去沉淀，將濾液蒸發濃縮至稠膏狀，真空干燥，得凍干粉。DMEM 培養基稀釋成母液，放入培養基中干預細胞。

1.2.5 實驗分組 按照細胞生長情況換補腎活血中藥血清培養液；實驗分A 組(誘導劑+中藥血清低濃度組 50 μg/ml)、B 組(誘導劑+中藥血清中濃度組100 μg/ml)、C組(誘導劑+中藥血清高濃度組 200 μg/ml)、D組(空白對照組，培養液為完全培養基)、E組(誘導劑組：完全培養基加入地塞米松、維生素C、甘油磷酸)、F組(NF-kB信號通路的特異性抑制劑IKK-DN 組)。

1.2.6 DAPI染色法檢測細胞凋亡 把用0.25%胰蛋白酶消化后的細胞分別放入10%含藥血清培養7天,放入TNF-α,分別于12 h、24 h后選出長有成骨細胞的蓋玻片,投入95%酒精固定15-30 min,微干,染色1 min。0.1M CaCl2處理2 min。用PBS漂洗幾次,每次漂洗時間一般為持續3秒。緊接著用PBS封片,放置于Nikon熒光顯微鏡下直接觀察并照相。

1.2.7 ELISA 法檢測培養液中RANK濃度 干預培養48 h取培養液。每孔分別放入樣品、樣品稀釋液，標準品各100 μl,37℃溫育30 min后分別放入酶標偶合液、底物、終止液50 μl于450 nm波長讀取OD值。樣品、標準品均設復孔，每個樣本重復1次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 成骨細胞鑒定

經形態學、Ⅰ型膠原免疫組化及堿性磷酸酶活性檢測判定為成骨細胞。見圖1。

A：形態學 B：Ⅰ型膠原免疫組化和堿性磷酸酶活性檢測

2.2 破骨細胞鑒定

經酒石酸TRACP染色判定為破骨細胞。見圖2。

2.3 成骨細胞-破骨細胞共育體系判定

顯微鏡下觀察可見破骨細胞胞漿呈紅色陽性反應，胞核呈陰性。見圖3。

圖2 破骨細胞鑒定

圖3 成骨細胞-破骨細胞共育體系鑒定

2.4 補腎活血中藥提高ALP活性

與空白對照組比較補腎活血中藥低濃度組，誘導劑組明顯提高ALP活性，抑制劑組明顯降低ALP活性，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 補腎活血方對ALP活性的影響

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

2.5 補腎活血中藥減少細胞凋亡

DAPI染色是一種采用經典的DAPI進行細胞凋亡檢測的快速簡便的方法。在細胞發生凋亡的時候，染色質會濃縮，DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀看，正常細胞的細胞核一般呈藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈緊密濃染，或呈碎塊狀緊密濃染，同時顏色略顯白色。

補腎活血方低、中、高濃度組明顯減低細胞凋亡，誘導劑明顯增加細胞凋亡，抑制劑明顯減低細胞凋亡。見圖4。

圖4 細胞凋亡圖

2.6 補腎活血中藥升高RANK濃度

與空白對照組比較補腎活血方低、中、高濃度組、誘導劑組、抑制劑組均明顯升高RANK濃度，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 補腎活血方對培養液RANK濃度的影響±s)

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

3 討論

依據骨質疏松癥的病因病機和臨床體征,其與傳統醫學中“骨枯”“骨痿”疾病癥狀相似。中醫認為,補腎重在溫補腎陽,填補腎精。補腎活血中藥主要為補骨脂、熟地、黃芪、山茱萸、淫羊藿等組成,全方具有壯骨補腎,通絡活血的作用。研究表明[3,4],方中中藥淫羊藿的提取液對增長的礦化物沒有作用,然而對去睪丸后骨高轉化率能夠有效控制。且該藥對激素減少類骨質疏松(OP)具有明顯防治作用,可抑制骨吸收。謝華[5]等經過對中藥黃芪水提取液對防治大鼠類固醇性骨質疏松影響的觀察,表明激素組骨吸收較黃芪水提取液組增高69%,同時新骨的形成降低100%,骨小梁面積減少27%,從而表明黃芪能明顯防治類固醇性OP。史風芹等[6]發現高濃度的大黃可有效控制破骨細胞骨吸收,抑制破骨細胞在骨片上的侵蝕,使骨片上骨陷窩的數量明顯減少,然后將高濃度的大黃稀釋后,對破骨細胞在骨片上侵蝕的抑制性明顯降低。國內外臨床研究已證實,補腎活血中藥能促進骨形成,抑制骨吸收[7，8],且可以明顯改善骨質疏松癥患者的癥狀[9]及緩解疼痛。

本實驗研究結果證實，補腎活血中藥能夠增進成骨細胞的表達而有效控制破骨細胞的分化，通過實驗組各組間對比，證實NF-kB信號通路在骨代謝中的作用是促進破骨細胞的分化而抑制成骨細胞的形成，這與以往臨床研究的結果相一致[10]。研究已證實，OP的發生[11,12]是由于成骨細胞增殖分化的抑制或成骨細胞凋亡進程的加速，進而使骨形成少于骨吸收。NF-κB信號通路對成骨細胞的增殖分化以及凋亡過程都有著關鍵的作用。同時，破骨細胞對骨吸收和骨形成的動態平衡起著關鍵的作用，而NF-κB信號通路的活化被稱為是成熟破骨細胞存活[13]和發揮功能[14]的關鍵調節因子。本研究發現，補腎活血中藥低濃度組明顯增高ALP活性，抑制劑明顯減低ALP活性，與空白對照組對比差異均具有統計學意義(P<0.05)。補腎活血中藥低、中、高濃度組明顯增高RANK濃度，與空白對照組對比差異具有統計學意義(P<0.05)；抑制劑組明顯增高RANK濃度。補腎活血中藥低、中、高濃度組明顯減低細胞凋亡，誘導劑明顯增加細胞凋亡，抑制劑明顯減低細胞凋亡，與空白對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。表明補腎活血中藥可以提高ALP活性，減低細胞凋亡，增高RANK濃度，并通過調控NF-κB信號通路增進成骨細胞的表達而有效控制破骨細胞的分化，從而抗骨質疏松。

[1]王 鷗,邢小平.老年性骨質疏松癥發病機制及藥物治療發展[J].中國實用內科雜志,2011,31(8):584.

[2]曹克勇,王倩芬,王旭明，等.復合脈沖電磁場治療骨質疏松癥的臨床療效觀察[J].中國康復醫學雜志,2014,29(2):168.

[3]李青甫，吳 鐵，謝 華，等.淫羊藿提取液對去睪丸大鼠代謝的影響[J].中草藥.1993，24(12)：637.

[4]李青甫，廖進民，吳 鐵，等.淫羊藿提取液防治激素所致大鼠骨質疏松的實驗研究[J].中國藥學雜志.1996，31(8)：467.

[5]謝 華，吳 鐵，李朝陽，等.黃芪水提取液對大鼠的類固醇性骨質疏松的防治作用[J].中草藥.1997，29(1)：25.

[6]史風芹，于世鳳，張潤荃，等.大黃對破骨細胞性骨吸收作用的研究[J].現代口腔醫學雜志.1995，9(3)：193.

[7]許 兵，陳如平，劉 慧，等.補腎活血中藥對成骨細胞的影響[J].醫學綜述.2011，17(14)：2180．

[8]陳曉飛，陳素紅，呂圭源，等.補腎活血方治療骨質疏松癥機制研究及探討[J].中成藥.2011，33( 7):1130．

[9]向科明，賴洪華，莊 瓊，等.補腎活血法治療絕經后婦女骨質疏松癥 98 例臨床觀察[J].臨床和實驗醫學雜志，2011，10(13):1044．

[10]李文鋒，侯樹勛，張偉佳，等.TNF-α-NF-κB對成骨細胞分化過程中BMP-2-Smad1信號通路的影響[J].中國骨質疏松雜志，2011，1(2):39.

[11]Xing L，Boyce BF.Regulation of apoptosis in osteoclasts and osteoblastic cells[J].Biochem Biophys Res Comun，2005；328(3):709.

[12]Jilka RL，Weinstein RS，Parfitt AM，et al.Quantifying osteoblast and osteocyte apoptosis：challenge and rewards[J].J Bone Miner Res，2007；22(10):1492.

[13]Miyazaki T，Katagiri H，Kanegae Y，et al.Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts[J].J Cell Biol，2000；148(12):333.

[14]Jimi E，Nakamura I，Ikebe T，et al.Activation of NF-kappaB is involved in the survival of osteoclasts promoted by interleukin-1[J].J Biol Chem，1998；273:8799.

2015年廣東省中醫藥管理局課題( 20152063)，2015年深圳市科技研發資金基礎研究資助項目 (JCYJ2015033109 0820169)

1007-4287(2017)08-1443-04

林松青，男，46歲，主任中醫師，教授，碩導，從事中醫骨傷研究.

2016-04-24)