CD133基因啟動子的克隆與序列分析

王曉峰，張天夫，劉 新，劉曉軍

(1.吉林大學中日聯誼醫院 口腔科,吉林 長春130033；2.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科)

CD133基因啟動子的克隆與序列分析

王曉峰1，張天夫1，劉 新1，劉曉軍2*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 口腔科,吉林 長春130033；2.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科)

近些年來，口腔頜面部惡性腫瘤的發病率逐年增加[1]。雖然目前針對惡性腫瘤的治療手段有了很多新的進展,但仍有部分腫瘤患者不能治愈。自從腫瘤干細胞(CSCs)理論提出后，給腫瘤患者帶來了新的曙光[2]。有研究表明，CD133是某些頭頸部腫瘤干細胞的表面特異性標記[3，4]，我們推測CD133+細胞可能是頭頸部腫瘤的干細胞。所以我們克隆了CD133基因的啟動子并對其進行序列分析，為進一步探究CD133基因與腫瘤干細胞之間的關系提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DH5α菌株和質粒，來源于吉林大學中日聯誼醫院科研中心。DNA Marker及限制性內切酶SpeI、MluI(日本Takara 公司)。限制性內切酶PacⅠ，SalⅠ(英國NEB公司)。Trans2K Plus DNA Marker(上海寶曼生物技術公司)。Blood gDNA Miniprep Kit(美國Biomiga公司)。引物合成(上海生工技術有限公司)。

1.2 人CD133基因啟動子的克隆

1.2.1 DNA提取及PCR引物設計 按試劑盒說明書進行外周血細胞基因組DNA的提取，并電泳鑒定。從Genbank數據庫獲得人CD133基因啟動子的DNA序列，PCR產物的長度為1 810 bp。設計引物如下：

上游引物： 5’-GTAGTCGACCTTCAGTGCCTCTTTCAGT-3’；下游引物5’-GCCTTAATTAAGTGGGGATCTGCCTCAGTC-3’。

1.2.2 PCR反應 以人外周血基因組DNA為模板進行PCR反應，反應產物經電泳鑒定。進行PCR產物的回收，產物電泳鑒定后于-20℃保存。

1.2.3 DH5α感受態細菌的制備及CD133基因啟動子PCR產物TA克隆 制備DH5α感受態細菌， -80℃保存。進行CD133基因啟動子PCR產物的T-A連接，16℃，30 min。

1.2.4 重組質粒的提取 將TA連接產物進行轉化，進行重組質粒的提取，電泳鑒定。

1.2.5 重組質粒的酶切鑒定 對提取的重組質粒pMD18-pCD133進行酶切，電泳鑒定。

1.2.6 重組質粒測序鑒定 將酶切鑒定的重組質粒進行擴增，進行DNA測序。

2 結果

2.1 人CD133基因啟動子克隆的PCR結果

PCR產物經電泳檢測，可看到一清晰的擴增帶出現在1 810 bp附近，符合設計的人CD133基因啟動子的長度，電泳結果見圖1。

1：人CD133基因啟動子PCR產物; M：DNA marker D2000

2.2 酶切鑒定重組質粒pMD18-CD133的結果

應用限制性內切酶PacⅠ和SalⅠ-HF雙酶切質粒pMD18-CD133，酶切產物經電泳鑒定，在1 810 bp附近出現與CD133啟動子片段長度相符的電泳帶，酶切結果見圖2。

2.3 CD133的測序結果

應用Blast軟件進行測序，結果見圖3。

1：重組質粒pMD18-pCD133 ；M：DNA marker 2000;2：pMD18-pCD133經PacⅠ和SalⅠ-HF雙酶切

圖2 酶切鑒定pMD18-pCD133瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討論

現階段針對口腔頜面部惡性腫瘤的治療手段越來越多，但治療效果仍然不理想,復發率和轉移率依然很高。腫瘤干細胞理論的報道[2]給我們帶來曙光。尋找腫瘤細胞表面特異性標記物,通過篩選腫瘤干細胞,將會為進一步研究腫瘤發生、發展和預后帶來新的希望。目前研究表明,CD133 可能是很多腫瘤干細胞的表面標志。因此我們進行了CD133基因啟動子的克隆及序列分析，為進一步探究CD133基因的調控機制提供新的理論依據。

圖3 重組克隆質粒pMD18-T-CD133測序圖

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74.

[2]Mackillop WJ，Ciampi A，Till JE，et al．A stem cellmodel of human tumor growth， implications for tumor cell clonogenicassays[J]．Journal of the national cancer institute，1983，70:9．

[3]Zhou L,Wei X,Cheng L,et al. CD133,one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line[J].Laryngoscope,2007,117(3):455.

[4]Moon Y,Kim D,Sohn H,et al.Effect of CD133 overexpression on the epithelial-to-mesenchymal transition in oral cancer cell lines[J].Clin Exp Metastasis,2016,33(5):487.

吉林省教育廳“十三五”科學技術項目(JJKH20170822KJ) 吉林省直衛生專項項目(sczsy201525)

1007-4287(2017)08-1428-02

2017-04-21)

*通訊作者