圍手術(shù)期檢測肝細胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的臨床意義

趙何偉，顧殿華，周 兵，孫 勇

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院 肝膽胰外科，江蘇 淮安223300)

圍手術(shù)期檢測肝細胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的臨床意義

趙何偉，顧殿華，周 兵，孫 勇*

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院 肝膽胰外科，江蘇 淮安223300)

近年來，巢式復(fù)合酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)被廣泛用于實質(zhì)器官惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的檢測[1]。AFP mRNA和MAGE-1 mRNA是肝細胞癌患者常用的檢測指標[2]。本文分析這兩種mRNA在肝細胞癌診斷方面的臨床價值，探討圍手術(shù)期聯(lián)合檢測對于監(jiān)測術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

病例組(A組)：2015年1月-2016年1月期間我院肝膽外科收治的肝細胞癌患者66例，其中男/女：38/28;年齡45-62歲，平均年齡：(51.2+8.8)歲；診斷依據(jù)為術(shù)中病理；B組：同期收治的肝炎和肝硬化患者48例，其中男/女：19/29;年齡44-64歲，平均年齡：(50.2+8.4)歲；符合《中華醫(yī)學(xué)會第十一屆會議》關(guān)于病毒性肝炎和肝硬化的診斷標準[3]。排除合并惡性腫瘤的患者；C組：同期收治的肝臟轉(zhuǎn)移瘤31例，有胃腸、乳腺、肺等其他器官惡性腫瘤病史，CT表現(xiàn)為多發(fā)性病灶，增強掃描符合“早出晚歸”的特點，其中男/女：12/19;年齡43-66歲，平均年齡：(51.1+8.7)歲；D組：肝血管瘤50例，符合《中華醫(yī)學(xué)會第十一屆會議》關(guān)于肝血管瘤的診斷標準。其中男/女：23/27，年齡41-65歲，平均年齡：(52.1+7.9)歲；E組：健康志愿者40人，其中男/女：15/25，年齡43-67歲，平均年齡：(51.8+8.7)歲；5組患者的性別和年齡之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，具有可比性。參與本次研究的所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

病例組患者于圍手術(shù)期(術(shù)前1天、術(shù)后7天、術(shù)后28天)抽取肘正中靜脈血5 ml，對照組于住院期間或門診抽取任意時間肘正中靜脈血5 ml。通過聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法提取外周血中單核細胞。采用異硫氰酸呱法提取細胞中總RNA。RT-PCR設(shè)定的參數(shù)為：變性(96℃，30 s)，退火(56℃，60 s)，延伸(68℃，30 s)，循環(huán)40輪，所得產(chǎn)物為176 bp和101 bp，產(chǎn)物101 bp在2.0-瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像分析儀照相。表達AFPmRNA和MAGE-1mRNA的細胞株HepG2(北京生物研究院)作為陽性對照。如圖1。

M：DNA-Marker 0：含104癌細胞 1：含 103癌細胞 2：含102癌細胞 3：10個癌細胞 4：1個癌細胞 5：無癌細胞

圖1 外周血AFPmRNA檢測敏感性

1.3 儀器及試劑

RT-PCR Mx3000P由日本SANYO公司提供，RT-PCR檢測試劑盒及Taq DNA聚合酶由美國Promega公司提供，PRMI-1460培養(yǎng)基和DNA-Marker由德國Roche生物技術(shù)有限公司提供，其余實驗用緩沖液、稀釋液、分離液均來自北京中山生物科技有限公司。操作過程嚴格按儀器及試劑說明進行。

1.4 肝細胞癌根治術(shù)

66例肝細胞癌患者均行肝細胞癌根治術(shù)，根治術(shù)標準為全麻下徹底切除肉眼可見的腫瘤，清除癌栓，并完成相應(yīng)區(qū)域淋巴結(jié)清掃。單個病灶直徑≤2 cm者可在B超引導(dǎo)下通過射頻(RF)進行全病灶毀損。整個手術(shù)過程中遵循無瘤原則。

1.5 隨訪

對病例組患者進行為期3個月的隨訪，肝內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的診斷依據(jù)美國肝癌研究協(xié)會2006年制定的標準；肝外轉(zhuǎn)移依據(jù)臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析處理，計數(shù)資料用率表示，組間對比采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前病例組和對照組AFPmRNA、MAGE-1mRNA陽性率比較

術(shù)前病例組AFPmRNA和MAGE-1mRNA陽性率分別為58.2%和61.8%，二者均陽性占20.0%。肝轉(zhuǎn)移瘤組AFPmRNA陽性率為35.5%，與病例組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余各對照組陽性率極低，與病例組的差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 術(shù)前病例組和對照組AFPmRNA、MAGE-1mRNA陽性率比較

2.2 圍手術(shù)期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的檢測與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

通過比較，Ⅱ組患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率最高(76.5%)，Ⅲ組復(fù)發(fā)率最低(9.1%)，三組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，圍手術(shù)期AFPmRNA和MAGE-1mRNA均陽性的患者比單一陽性的患者復(fù)發(fā)率高，差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中IIb組患者復(fù)發(fā)率為100%;詳見表2。在為期3個月的隨訪中Ⅱ組死亡人數(shù)為3例(17.64%)，Ⅲ組死亡人數(shù)為1例(4.54%)，Ⅰ組無死亡患者；總死亡率為6.06%；圖2為IIb組中的一個患者通過RT-PCR檢測圍手術(shù)期外周血AFPmRNA的凝膠成像結(jié)果。

表2 圍手術(shù)期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的檢測與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

注：1與2相比，P=0.018；1與3相比，P=0.024；2與3相比，P=0.000 Ⅰ組：術(shù)前術(shù)后持續(xù)陽性(Ia：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；Ib：二者均陽性)；Ⅱ組：術(shù)前陽性，術(shù)后7天陰性，術(shù)后28天陽性(IIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；IIb：二者均陽性)；Ⅲ組：術(shù)前陽性，術(shù)后陰性(IIIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA陽性；IIIb：二者均陽性)。

M：DNA-Marker N：陰性對照 P：陽性對照 I：手術(shù)前1天(+) 2：術(shù)后7天(-) 3：術(shù)后28天(+)

圖2 肝細胞患者圍手術(shù)期AFPmRNA檢測結(jié)果

3 討論

原發(fā)性肝癌作為一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，流行病學(xué)顯示在亞太地區(qū)具有較高的發(fā)病率[4]。組織學(xué)顯示肝細胞癌的發(fā)病率較隱匿，早期的臨床癥狀一般不明顯的表現(xiàn)，這樣給早期肝癌發(fā)現(xiàn)和診斷造成了較大的難度，在以往的病例研究資料中顯示肝癌患者的發(fā)現(xiàn)大多數(shù)處于中晚期，同時由于肝細胞癌的高侵襲性和高復(fù)發(fā)性等特點，會造成肝細胞癌的死亡率極高[5]。

AFP(甲胎蛋白)作為一種臨床上篩選肝細胞癌變腫瘤術(shù)后檢測的重要血清學(xué)指標在臨床上使用廣泛,但是極易受到非癌性病變的疾病(慢性乙性肝炎、肝硬化)影響。部分學(xué)者指出相對于血清學(xué)AFP的蛋白檢測，分子RNA檢測更為準確可靠[6]。AFP的基因位于人類第4號染色體上，胎兒時期在干細胞和卵黃囊中合成，出生后會隨著白蛋白的合成增加而迅速的下降。AFP基因在正常人肝細胞中呈現(xiàn)極低表達狀態(tài)，在肝癌患者中呈現(xiàn)高表達[7]。MAGE是一類腫瘤特異性的抗原，是位于人類X染色體長臂末端的MAGE基因家族編碼，由12個基因成員組成，以往研究中顯示MAGE-1基因在原發(fā)性肝癌組織中呈現(xiàn)著特異性的高表達狀態(tài)[8]。本次研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA的陽性率要顯著的高于健康人群、非癌變的慢性肝病和非肝癌患者(P<0.05)。與宋愛英等研究結(jié)果一致[9]。外周血液的AFPmRNA、MAGE-1mRNA不但對于診斷原發(fā)性肝癌具有重要特異性，在圍術(shù)期的復(fù)發(fā)預(yù)測上也具有重要的意義，本次研究中發(fā)現(xiàn)在術(shù)前術(shù)后均陽性的患者隨訪3個月術(shù)后復(fù)發(fā)率要顯著的高于術(shù)后陰性的患者(P<0.05)。肝癌患者圍術(shù)期外周血中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA可以對術(shù)后的肝癌復(fù)發(fā)率具有較好的預(yù)測和評價[10，11]。

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南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金項目(2016NJMUZD086)

1007-4287(2017)08-1362-03

2017-07-20)

*通訊作者