CXCL12-G801A基因多態(tài)性在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究

黃佳濱,隋小芳,王鳳玲,袁博洋,劉 影,范巧菊

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

*通訊作者

CXCL12-G801A基因多態(tài)性在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究

黃佳濱,隋小芳*,王鳳玲,袁博洋,劉 影,范巧菊

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

肺癌是多基因以及多因素參與的疾病，發(fā)病機(jī)制還有影響預(yù)后的因素還不夠明確，診斷以及治療技術(shù)仍然需要改進(jìn)。其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌患者的比例>80%，但是該病患者的5年生存率只有10%左右[1]。雖然非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后判斷依據(jù)主要是組織學(xué)類型以及臨床分期，不過有著相同特點(diǎn)的該病患者應(yīng)用相同的治療措施，預(yù)后質(zhì)量可能存在很大的區(qū)別。這就需要進(jìn)一步探討該病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程當(dāng)中，趨化因子發(fā)揮著重要的影響，部分趨化因子可以刺激腫瘤增殖，加速血管的形成，從而使得腫瘤細(xì)胞移動(dòng)并且粘附到內(nèi)皮細(xì)胞當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。另一部分趨化因子可以控制腫瘤血管以及腫瘤細(xì)胞的形成，激發(fā)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，有效預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)[2]。本研究選取非小細(xì)胞肺癌患者以及健康人群，對(duì)比CXCL12-G801A基因多態(tài)性在兩組對(duì)象當(dāng)中的區(qū)別，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月到2013年1月我院收治的NSCLC患者中408例為研究組，均未進(jìn)行放化療，同時(shí)選取同期健康體檢人員303例為對(duì)照組，同研究組對(duì)象之間不存在血緣關(guān)系。兩組研究對(duì)象均知情同意，并且經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集兩組研究對(duì)象的性別、年齡以及吸煙史等資料，兩組患者一般資料有可比性(P>0.05)，見表1。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑。主要儀器：壓力滅菌器(美國(guó)MILLIPORE公司)、超純水儀(上海任氏電子公司)、Diagnostics酶標(biāo)儀(美國(guó)MILLIPORE公司)、L420低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)公司)、基因擴(kuò)增儀TC-XP(德國(guó)Bioer公司)、電泳槽DYC-31D(北京六一廠)。主要試劑：限制性內(nèi)切酶(上海Sangon公司)、PCR引物(上海Sangon公司)、dNTP(美國(guó)MILLIPORE公司)、瓊脂糖(BBI公司)、Taq DNA聚合酶(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2.2 樣本采集方法。兩組研究對(duì)象在無菌條件下采集5 ml靜脈全血，加入構(gòu)椽酸鈉試管當(dāng)中混勻，冰箱保存?zhèn)溆茫渲斜４娴臅r(shí)間應(yīng)當(dāng)<7 d，提取血細(xì)胞的DNA[3]。

1.2.3 DNA提取方法。取出標(biāo)本并在室溫條件下解凍，吸取1 000 μl的血液放入到EP管當(dāng)中，在血液當(dāng)中添加1 000 μl Tip并且充分混勻，之后3 000 r/min持續(xù)分離5 min之后棄上清。重復(fù)進(jìn)行該步驟，如果血樣仍為紅色需要繼續(xù)重復(fù)。如果沉淀為淡紅色使用200 μl的TE懸浮[4]。添加500 μl的Cell lysis solution到樣本當(dāng)中充分混勻，添加5 μl的Pro tein K之后在60℃條件下孵育10 min。使用70%的乙醇沉淀顆粒，在空氣當(dāng)中干燥5 min，從而溶解DNA顆粒到純水當(dāng)中保存[5]。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料比較(例，%)

1.2.4 DNA鑒定方法。將提取得到的基因組DNA，在脂糖凝膠當(dāng)中電泳30 min之后，將凝膠轉(zhuǎn)移到像系統(tǒng)下完成觀察，溶解DNA使用蒸餾水根據(jù)比例稀釋到100 ng/ul，震蕩器持續(xù)震蕩30 s之后離心備用，作為PCR反應(yīng)當(dāng)中的DNA模板[6]。

1.2.5 PCR擴(kuò)增方法。PCR反應(yīng)體系是25μl，離心混勻之后置入PCR擴(kuò)增儀。2%的瓊脂糖凝膠電泳用來鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將特異性內(nèi)切酶置于恒溫箱當(dāng)中消化2 h，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳來分析結(jié)果。

1.2.6 PCR產(chǎn)物分析方法。將制備得到的膠板置入水平電泳槽，使用稀釋的1xTAE液。吸取2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物之后加樣到瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加樣陰性對(duì)照(未添加DNA模板)及陽(yáng)性對(duì)照(穩(wěn)定PCR產(chǎn)物)。通電之后穩(wěn)壓在100 V，設(shè)定電泳的時(shí)間為10 min。電泳完成之后取出凝膠，在紫外燈下同Marker條帶對(duì)比，從而確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，使用PCR-RFLP法實(shí)現(xiàn)CXCL12-G801的基因分型[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS18.0分析，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CXCL12-G801A同非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系方面，兩組研究對(duì)象的 G/G基因型、A/A基因型以及A/G基因型頻率對(duì)比無明顯區(qū)別(P>0.05)，見表2。

表2 CXCL12-G801A同非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系(例，%)

CXCL12-G801A等位基因分布同非小細(xì)胞肺癌的易感性聯(lián)系方面，兩組研究對(duì)象的多態(tài)性等位基因頻率對(duì)比無明顯區(qū)別(P>0.05) ，見表3。

表3 XCL12-G801A等位基因分布同非小細(xì)胞肺癌病理分期的關(guān)系

3 結(jié)論

肺癌患者當(dāng)中絕大多數(shù)屬于非小細(xì)胞肺癌，因?yàn)樵摬〉脑缙谠\斷率比較低，導(dǎo)致患者在臨床確診之后已經(jīng)錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，所以放化療成為治療非小細(xì)胞肺癌晚期患者的常用方法[8]。有研究人員發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者化療的效果以及預(yù)后生存同基因變異以及表達(dá)水平存在聯(lián)系。非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后質(zhì)量較差，主要是因?yàn)樵摬≡陂L(zhǎng)段時(shí)間內(nèi)缺乏典型的臨床癥狀，患者在確診之后己經(jīng)屬于晚期，難以進(jìn)行手術(shù)治療[9]。臨床實(shí)踐顯示，有著類似臨床特征并且采取相同治療措施的患者，生存時(shí)間也可能存在區(qū)別。這一方面同患者的個(gè)體體質(zhì)存在聯(lián)系，另一方面也受遺傳變異等因素的潛在影響。

趨化因子CXCLl2作為基質(zhì)衍生因子的一種，在淋巴細(xì)胞發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫炎癥調(diào)節(jié)以及血管生成等領(lǐng)域都有著不容忽視的重要影響。在編碼CXCLl2基因轉(zhuǎn)錄區(qū)存在801位鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)的多態(tài)性，也就是CXCLl2-G801A。研究人員最初克隆小鼠骨髓的基質(zhì)細(xì)胞，其中鼠以及人體的CXCLl2有氨基酸序列相同程度>99%。人體當(dāng)中的CXCLl2-G801A主要是骨萌基質(zhì)細(xì)胞以及組織間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分泌，同時(shí)在肺、腦、骨骼以及肝臟等多種細(xì)胞以及組織當(dāng)中都有表達(dá)[10]。CXCLl2屬于高效淋巴細(xì)胞以及單核趨化因子，在人體造血干細(xì)胞歸巢骨髓的過程當(dāng)中有著重要的作用。CXCLl2借助于同受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能，可以同CXCLl2進(jìn)行結(jié)合的相關(guān)趨化因子受體主要是CXCR4以及CXCR7。相關(guān)研究的結(jié)果顯示，CXCR7在人體腫瘤轉(zhuǎn)移以及腫瘤侵襲的過程當(dāng)中都有重要的影響。近年來最新研究結(jié)果顯示肌肉瘤細(xì)胞當(dāng)中的CXCR7表達(dá)要顯著高于CXCR4，二者同正常橫紋肌細(xì)胞對(duì)比均呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[11]。

研究顯示CXCLl2-G801A基因位點(diǎn)多態(tài)性同HIV感染、哮喘以及自身免疫疾病存在一定的聯(lián)系。人類CXCLl2一共包括6種基因型，在轉(zhuǎn)錄的過程當(dāng)中剪切方式的不同導(dǎo)致不同種型形式的出現(xiàn)。CXCLl2-G801A基因的變異位于CXCLl213基因片段，往往會(huì)影響到CXCLl213的產(chǎn)生量。研究人員最早發(fā)現(xiàn)這一多態(tài)性影響到HIV患者的感染進(jìn)程[12]。G/A雜合子能夠明顯延緩HIV患者疾病的發(fā)展進(jìn)程，同時(shí)A/A純合子HIV患者的生存時(shí)間往往比較長(zhǎng)，同時(shí)是暴露在HIV病毒當(dāng)中的發(fā)病時(shí)間也顯著延遲。體外研究的結(jié)果顯示，CXCLl2-G801A的多態(tài)性保護(hù)效果主要是借助于穩(wěn)定CXCLl2RNA，增加CXCLl2-G801A的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。CXCLl2保護(hù)效果在自身免疫腦脊髓炎相關(guān)動(dòng)物模型當(dāng)中也得到證實(shí)。本研究的結(jié)果顯示，研究組以及對(duì)照組的吸煙個(gè)體比例是39.0%以及36.6%，兩組研究對(duì)象之間不存在明顯的區(qū)別(P>0.05)，推測(cè)同樣本數(shù)量比較有限存在聯(lián)系。研究組當(dāng)中存在家族腫瘤史以及不存在家族腫瘤史的個(gè)體比例是78.7%以及21.3%，兩組比較無明顯區(qū)別(P>0.05)。研究組以及對(duì)照組研究對(duì)象的CXCLl2-G801A 3種不同基因型(G/G，G/G以及G/A)的頻率分別為56．0%、4.9%、39．1%以及73．3%、3.0%以及23．7%。兩組患者3種基因型之間的分布對(duì)比，無明顯的區(qū)別(P>0.05)。研究組還有對(duì)照組研究對(duì)象的CXCLl2-G801A的G/G基因型分布頻率是59.6%以及66.4%，研究組以及對(duì)照組的研究對(duì)象CXCLl2-G801A的A/G頻率是30.2%以及25.7%。A/G基因型以及G/G基因型對(duì)比而言，兩組研究對(duì)象之間的基因型分布無明顯區(qū)別(P>0.05)，G/A基因型以及G/G基因型對(duì)比而言，兩組研究對(duì)象的基因型分布無明顯區(qū)別(P>0.05) 。研究組以及對(duì)照組研究對(duì)象G/A基因的分布頻率是72.2%。75．9%以及27．8%、24．1%，G/A基因的頻率分布無明顯區(qū)別(P>0.05) 。本研究采用研究組以及對(duì)照組的對(duì)比研究，不過本實(shí)驗(yàn)的研究組以及對(duì)照組研究對(duì)象均來自于我院，受種族、地域、樣本數(shù)量、環(huán)境以及個(gè)體差異等方面因素的影響，本研究只針對(duì)CXCLl2-G801A位點(diǎn)以及家族史、吸煙史等危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，存在一定的局限性。這是因?yàn)槎鄠€(gè)危險(xiǎn)因素彼此之間可能會(huì)發(fā)生相互影響，從而生成不同的效果，所以CXCLl2-G801A的基因多態(tài)性同非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然需要深入的研究。

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2016-07-20)