特定行業污水中四環素類抗生素的調查分析

劉熙熙+沈曉東++汪卉

【摘要】：建立了測定水樣中四環素類抗生素的高效液相色譜分析方法，采取多種前處理方法進行優化與對比，以蘇州市陽澄湖周圍水體作為研究對象，調查總結其中三類四環素類抗生素的含量。在色譜條件中采用乙腈、草酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，流速為1mL/min，波長為300nm，分析時間10分鐘，線性關系良好。

【關鍵詞】：四環素類抗生素；高效液相色譜；萃取

【引言】：抗生素（antibiotics）是一種天然或者半人工合成的，能在低微濃度下有選擇性地抑制或影響生物。自從1928年發現青霉素以來，人類開始廣泛使用抗生素，并且在家禽飼養、水產養殖和食品加工等方面廣泛運用。隨之而來的是在環境中殘留的抗生素污染越來越嚴重。

抗生素污染已成為目前國際研究熱點之一。水環境下抗生素的研究集中在北美等發達國家，國內也已陸續展開了相關工作。已有的研究很少涉及能夠真正反映養殖場藥物使用情況的排水口水體和下游水體中抗生素的變化。通過深入關注和了解有關抗生素方面的一些新聞報道和研究文獻，發現養殖場附近的水體中殘留抗生素較多，其中含量最多，最普遍的便是四環素類抗生素。 為了促進動物生長和預防疾病爆發，普遍都在家畜、家禽和水產養殖飼料中添加抗生素，一部分將在生物體內吸收或轉化，并以代謝物的形式排出體外。

為了研究四環素類抗生素對養殖水體的污染情況，將以過去的研究數據為基礎，通過高效液相色譜檢測方法，多種前處理方式，對蘇州魚塘周圍水體進行采樣分析，調查總結蘇州特定水環境中四環素類抗生素的來源及含量，以期為達到控制和去除四環素類抗生素提供方向和依據。

1、材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）；氮吹儀TTL-DCI；快速混勻器SK-1；離心機TGL-16G；恒溫水浴鍋；超聲波清洗器KQ-100E；C18 6mL（500mg）小柱。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、丙酮（色譜純）；超純水；四環素、土霉素、金霉素固體標準物質；草酸（分析純）。

1.3 高效液相色譜分析條件

選用色譜柱（Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）），柱溫：30℃，波長：300nm，流速：1mL/min，流動相：乙腈/0.01mol/L草酸，進樣量：20μL，流動相中草酸PH：2.4，采用梯度洗脫程序（表1），其中A相為乙腈，B相為0.01mol/L草酸。

1.4實驗方法

1.4.1標準溶液配置

稱取三種四環素類抗生素標準物質，用甲醇配制單標儲備液及混標儲備液，置于棕色瓶內放冰箱避光保存。

1.4.2標準曲線制備

將混標儲備液與超純水混合，形成濃度為1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ppm的標準系列溶液，按色譜條件進樣，以濃度（ppm）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.3水樣前處理

水樣在前處理之前均采用0.22μm尼龍濾膜進行過濾。

1） 離子液體輔助分散液液微萃取

保持混合有機物：40μL（乙腈：1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽 = 1：1）和水樣體積不變，同時改變酸化的溶液（乙酸和草酸）時，觀察離子液體（1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽）的萃取效率。最后用離子液體用無菌注射器抽出，200μL的流動相復溶。

2） 丙酮-無水硫酸銨雙水相萃取

配制一定量的水樣和硫酸銨鹽溶液，置于一定溫度水浴中使鹽溶解；移取6 mL儲備液至10 mL 離心管中，加入0.8mL丙酮；渦旋3min后離心5min至分相；用1 mL注射器從上相取樣。

3） 無水乙醇+ 丙酮-硫酸銨體系萃取

同丙酮-無水硫酸銨體系實驗方案類似，關鍵在于丙酮與乙醇的比例關系。確定無水乙醇和丙酮以1∶2 組合溶于水相中效果最佳。

4） 固相萃取

樣品凈化： C18柱在使用前先用甲醇水溶液（2：1）進行活化后加入水樣，適當控制流速，待樣品液全部流出后用95%甲醇水溶液洗滌柱子，棄去流出液，再加入5mL甲醇洗脫，收集洗脫液。

樣品濃縮： 將洗脫液于氮吹儀吹干后，加入1mL流動相定容。

1.4.4樣品測定

定容后經0.22μm的尼龍濾頭過濾，吸取20μL進樣，進行HPLC分析，記錄三種抗生素保留時間及峰面積。

2 、結果與討論

2.1色譜條件優化

選取乙腈、甲醇和0.01mol/l草酸溶液作為流動相，流速：0.8ml/min，波長：267nm，對三種物質分離，結果顯示OTC和TC沒有完全分離，且峰

值有拖尾現象；隨后，改用乙腈和0.01mol/l草酸溶液作為流動相，進行梯度洗脫，流速：1mL/min，波長：300nm三者分離度都有所提高，OTC和TC相比OTC出峰效果明顯，兩者出峰時間較接近，通過優化梯度洗脫中流動相比例以及比例變換時間，將檢測時間縮短到10分鐘之內，使分析時間大大縮短。

1.土霉素；2.四環素；3.金霉素

圖1.混合標準溶液分離色譜圖

2.2萃取方法選擇

雙水相萃取和分散液液微萃取技術相比固相萃取成本低，操作簡單，變通性強，為提高萃取效果，對萃取劑進行多次篩選，最終確定以無水乙醇+ 丙酮-硫酸銨體系萃取，按適當比例進行萃取進樣，結果表明無水乙醇和丙酮以1∶2 組合溶于水相中效果最佳。

固相萃取不用大量互不相溶的溶劑，富集倍數、回收率高，選取萃取柱C18，甲醇為洗脫溶劑萃取，控制適當流速，效果顯著。

兩種萃取技術最終結果顯示固相萃取技術萃取效率較高。

2.3工作曲線與檢出限

抗生素 回歸方程 相關系數 標準偏差 方法檢出限

OTC y = 18.49x - 0.357 0.997 2.08% 0.15

TC y = 17.20x - 0.737 0.999 1.40% 0.14

CTC y = 9.794x - 2.488 0.997 1.88% 0.08

表2.三種抗生素的線性關系分析和方法檢出限

按照不同濃度制定標準曲線，由表2可以看出三種四環素類抗生素的工作曲線線性關系良好，并計算得出方法檢出限MDL。

結 論

本研究采用固相萃取和雙水相萃取多種前處理方法對水樣進行富集，結果表明固相萃取效果較好，但并不表示雙水相萃取技術不可行，該技術成本低，耗時也比固相萃取少，是一個有研究價值的技術，還需從各個條件下進行優化，固相萃取技術已成熟，經C18柱富集后，以乙腈-草酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1mL/min，波長為300nm，結果表明線性關系良好。

【參考文獻】：

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