UPLC-MS/MS法測定電子煙煙油中TSNAs的含量

陳國輝，李映梅，董勝強，楊 燕，侯 英

(1.云南瑞升煙草技術(集團)有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同創檢測技術股份有限公司，云南 昆明 650106)

UPLC-MS/MS法測定電子煙煙油中TSNAs的含量

陳國輝1，李映梅2*，董勝強2，楊 燕2，侯 英2

(1.云南瑞升煙草技術(集團)有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同創檢測技術股份有限公司，云南 昆明 650106)

為快速準確測定電子煙煙油中的煙草特有亞硝胺(TSNAs)，對前處理條件進行優化，建立了煙油中TSNAs的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)方法，結果表明：使用HLB固相萃取小柱進行凈化，可以很好地去除雜質干擾； NNK、NNN、NAT、NAB的檢出限為0.005～0.020 ng/g，定量限為0.015～0.067 ng/g，3個加標水平的回收率為85.16%～105.79%；通過對6個不同品牌電子煙煙油中TSNAs的測定，NNN的檢出率和含量是最低的，因此，該方法穩定、準確，適用于測定電子煙煙油中TSNAs的含量。

UPLC-MS/MS;TSNAs;HLB固相萃取;電子煙煙油

自2004年電子煙發明以來，全球抽吸電子煙的人數都呈現快速增長的趨勢[1-3]，電子煙的品質和安全性等問題日益凸顯[4-7]，各個國家也開始對電子煙進行了監管和相關的研究[8]。2016年5月5日，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)發布了有關電子煙的新規定，將電子煙視同為煙草產品進行監管。

電子煙又名電子煙堿傳送系統，電子煙的煙堿幾乎都是從煙草中提取的，而TSNAs是在煙草調制和儲存過程中由亞硝酸鹽與煙草生物堿反應形成的[9-13]，TSNAs會引起動物鼻腔、肝、胰等組織的癌變[14-15]，對人體危害極大。TSNAs的含量極低、基質干擾大，給定量分析帶來了一定的難度[16-18]。相關專利和文獻報道電子煙煙油中NNK、NNN、NAT、NAB含量的測定可采用GC-MS法[9]、LC-MS/MS法[17]、RP-GC-TEA法(基質固相分散-氣相色譜熱能檢測法)[19]。實驗室根據實際情況，建立了UPLC-MS-MS準確測定電子煙煙油中的TSNAs的方法，試圖通過對電子煙煙油中TSNAs含量進行對比，為準確客觀評價電子煙油中TSNAs含量情況提供技術手段，對電子煙安全性的評價具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇(色譜純，Dikma)；乙腈(色譜純，Dikma)；乙酸(分析純)；甲酸(分析純)；超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)；乙酸銨(分析純)；氘代-4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl-d4)-1-butanone(NNK-d4，純度≥99%)；氘代-N-亞硝基降煙堿，rac N′-Nitrosonornicotine-d4(NNN-d4，純度≥99%)；N-亞硝基假木賊堿，(R,S)-N-Nitrosoanabasine(NAB純度≥98%)；N-亞硝基新煙堿，(R,S)-N-Nitrosoanatabine(NAT，純度≥98%)；4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK，純度≥98%)；N-亞硝基降煙堿，rac N′-Nitrosonornicotine(NNN，純度≥98%)；色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；固相萃取柱：Oasis HLB(60 mg/3 mL，美國Waters公司)；高純氮氣(純度大于99.999%)。

液相色譜串聯質譜儀：1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Agilent 6460三重四級桿液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(美國Agilent公司)；分析天平(瑞士梅特勒，型號：AB204-S，感量0.1 mg)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 各稱取約10.0 mg的NNK-d4和NNN-d4，用甲醇完全溶解后，分別轉移至2個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1.0 mg/mL的內標儲備液。分別移取1.0 mL NNK-d4和NNN-d4的1.0 mg/mL內標儲備液至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為10.0 μg/mL的NNK-d4和NNN-d4一級混合內標溶液。該溶液于-18 ℃條件下避光保存，有效期為6個月。

各稱取約10.0 mg的NAB、NAT、NNK、NNN，用甲醇完全溶解后，分別轉移至4個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1.0 mg/mL的標準儲備液。該儲備液于-18 ℃條件下避光保存，有效期為6個月。

1.2.2 樣品處理與分析 準確稱取0.2～0.5 g樣品于錐形瓶中，加入5.0 mL去離子水，準確加入200 μL 100 ng/mL的內標溶液，渦旋1 min，超聲5 min，1000 r/min離心5 min，上清液待凈化，Oasis HLB固相萃取小柱預先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上清液全部倒入固相萃取小柱中，待樣品溶液自然流盡后，用3 mL 2%甲醇水溶液淋洗，最后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液氮氣吹干，加入2.0 mL濃度為0.1 mol/L的乙酸銨溶液超聲溶解，經0.2 μm濾膜過濾至進樣瓶中，待測定。

高效液相色譜參考條件：色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%的乙酸溶液,梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

質譜參考條件：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；電噴霧電壓：5000 V；各分析物質譜檢測參數見表2。

表2 TSNAs及內標物的質譜檢測參數

2 結果與分析

2.1 前處理條件的確定

2.1.1 萃取方式的優化 目前，常用的提取凈化方法為直接使用乙酸銨水溶液過濾進樣，筆者驗證了該方法，這種方法對于添加了煙草提取物的煙油凈化不足，有很大的基質干擾，定量和定性都不準確。在CORESTA建議的方法中，水溶液提取后，使用HLB固相萃取小柱進行凈化，在驗證該方法后，對雜質有較強的去除效果，因此選擇該方法作為提取凈化電子煙煙油方法。

2.1.2 萃取時間的優化 加入水提取時間設定為0、5、10、15、30 min，考察不同提取時間對提取效果的影響。結果表明，超聲5 min后檢測結果并沒有變化，因此，選擇5 min作為超聲時間。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關系和檢出限 配制濃度為0.20～50 ng/mL系列濃度的TSNAs標準混合工作溶液，用液相色譜串聯質譜測定，得到TSNAs積分峰面積，以峰面積作為縱坐標，用于制作標準曲線，對校正數據進行線性回歸，回歸方程和相關系數見表3。

檢測器產生的響應信號為噪聲值3倍時的量為檢出限，檢測器產生的響應信號為噪聲值10倍時的量為定量限，并通過定容體積和樣品量換算得到樣品的檢出限和定量限，具體見表3。

從表3可以看出，TSNAs的相關系數大于0.999，表明在一定濃度范圍內線性關系良好，檢出限和定量限較低，說明該方法的檢出限和定量限低于文獻報道的數值，因此，該方法有較好的靈敏度、較低的檢測限，能夠很好地滿足檢測的要求。

表3 標準曲線線性方程、相關系數、檢出限和定量限

注:線性方程中的A為峰面積，C為各組分的濃度，單位為ng/mL。

表4 TSNAs的重現性結果

2.2.2 重復性與重現性 選取樣品稱取6次，樣本進行前處理，測定TSNAs含量，在相同條件下進行3 d的測定，其日內和日間的相對標準偏差見表4。由表4可知，該方法的連續3 d的RSD在2.10%～8.69%之間，3 d的RSD分別為6.28%、6.08%、5.42%和7.50%，說明該方法對TSNAs的測定具有較好的重現性。

2.2.3 回收率 采用加入TSNAs標準物質低、中、高3個梯度(20、50、200 ng/g)進行加標實驗，驗證該方法的準確性，每個濃度平行進行3次實驗，分別得到了TSNAs的回收率(表5)。由表5可知，建立的分析方法回收率86.74%～105.79%，滿足電子煙煙油中TSNAs含量的檢測要求。

2.3 樣品檢測

采集了市場中的6種煙油進行了檢測，結果見表6，對實際樣品進行了TSNAs檢測，4種TSNAs含量都較低，表明這可能與該煙油配方中加入煙草提取物含量有關。TSNAs在樣品中均有不同程度的檢出，NNN的檢出率和含量均是最低的，該規律類似于煙草制品[20]。

表5 TSNAs的加標回收率

表6 6個電子煙油樣品中TSNAs檢測結果 ng/g

注:N.D表示未檢出或低于檢出限。

3 結論

實驗室通過優化前處理，選擇HLB固相萃取小柱進行凈化，建立了超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜法測定電子煙煙油中TSNAs的方法。得出以下結論：(1)檢出限和定量限較低、重現性較好、回收率較好，能夠滿足電子煙煙油中TSNAs含量的檢測要求；(2)通過對實際樣品的檢測，NNN的檢出率和含量均是最低的，這個規律類似于煙草及煙草制品。

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(責任編輯：曾小軍)

Determination of Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) Content in Electronic Cigarette Liquid by Using UPLC-MS/MS Method

CHEN Guo-hui1, LI Ying-mei2*, DONG Sheng-qiang2, YANG Yan2, HOU Ying2

(1. Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Limited Company, Kunming 650106, China; 2. Yunnan Comtestor Detection Technology Limited Company, Kunming 650106, China)

An improved method was developed to rapidly and accurately determine four kinds of tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) in electronic cigarette liquid by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method. The results showed that using HLB solid-phase extraction column could well purify the TSNAs in electronic cigarette liquid. The limit of detection for NNK, NNN, NAT and NAB in samples was 0.005～0.020 ng/g, and the limit of their quantification ranged from 0.015 ng/g to 0.067 ng/g. The recovery of 3 analytes varied from 85.16% to 105.79%. This method was used for the determination of TSNAs content in the liquid of 6 brands of electronic cigarette, and it was found that both the detection rate and the content of NNN were the lowest. Therefore, this method is stable and accurate, and it is suitable for the determination of TSNAs content in liquid of electronic cigarette.

UPLC-MS/MS; TSNAs; HLB solid-phase extraction; Electronic cigarette liquid

2017-04-27

陳國輝(1983─)，男，山東聊城人，工程師，碩士研究生，從事卷煙及其制品的研究和檢測工作。*通訊作者：李映梅。

O657.63

A

1001-8581(2017)08-0110-04