豬場水源水及管網水腸球菌耐藥特性差異研究

林云琴,曾中華,陳如登

(1.福建省福清市畜牧獸醫中心,福建 福清 350100;2.福建省漳州市動物疫病預防控制中心,福建 漳州 363000; 3.福建省農產品質量安全檢驗檢測中心,福建 福州 350000)

豬場水源水及管網水腸球菌耐藥特性差異研究

林云琴1,曾中華2,陳如登3

(1.福建省福清市畜牧獸醫中心,福建 福清 350100;2.福建省漳州市動物疫病預防控制中心,福建 漳州 363000; 3.福建省農產品質量安全檢驗檢測中心,福建 福州 350000)

從福州地區9個豬場不同來源的飲用水中分離獲得42株腸球菌。采用微量肉湯稀釋法對這些分離菌進行藥物敏感性實驗,測定了它們對6種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)。結果表明：這些分離菌對土霉素、紅霉素、氯霉素、環丙沙星、氨芐西林和萬古霉素的耐藥率分別為80.95%、66.67%、35.71%、19.05%、16.67%、14.29%；水池進水口及蓄水池分離菌對土霉素和紅霉素的耐藥率略低于飲水器飲用水分離菌的，但對氯霉素、環丙沙星、氨芐西林的耐藥率均顯著低于飲水器分離菌的;保育舍飲水器分離菌對所有抗生素都有更高的耐藥率；所分離的腸球菌共有11種耐藥譜,發現有11株分離菌對4～5種抗生素耐藥,其中5株來自保育舍飲水器；水池進水口及蓄水池分離菌的多重耐藥率均低于飲水器分離菌的,以保育舍飲水器分離菌的多重耐藥率最高。

豬場;飲用水;腸球菌;抗生素；耐藥性;飲水管網

目前細菌耐藥問題引起了人們的普遍關注,已經開展大量研究對病原微生物的耐藥現狀進行監控[1-4],同時對其耐藥基因(ARGs)進行密集監測[5-7],了解其可能的傳播途徑。腸球菌是人類及畜禽腸道常見菌群之一,是糞便污染指示菌之一。腸球菌的來源相當廣泛,存在于人類生活污水、動物糞便以及無脊椎動物、植物、土壤等環境中[8]。近年來的研究表明,糞腸球菌和屎腸球菌越來越成為條件致病菌,是醫院內感染的重要致病菌,其在致病性革蘭氏陽性球菌中的地位僅次于葡萄球菌。

開展養殖場環境中細菌耐藥性研究具有特別重要的意義。目前國內外關于養殖場細菌耐藥方面的研究,大多是對養殖場糞便、廢水、沼氣池以及周邊水環境的研究[9-10],而對畜禽飲用水管網中的細菌耐藥性研究目前鮮見報道。國內養豬場飲水管網很少得到清洗,又經常進行飲水給藥的操作,使飲水管網中富集大量的耐藥細菌,從而可能對飲水品質產生影響。

我們探討了豬場飲用水中細菌在經過飲水管網前后的耐藥特性的變化,了解豬場飲用水中腸球菌的耐藥及分布情況,明確飲水管網對飲用水中腸球菌耐藥的影響,旨在為豬場飲用水細菌耐藥性研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基及PCR試劑 本實驗所用的培養基主要有:胰蛋白大豆營養瓊脂(OXOID CM0131)、腸球菌選擇培養基(OXOID CM0377)、M-H肉湯。PCR反應所需試劑主要購自鼎國生物和上海生工。

1.1.2 質控標準菌 糞腸球菌(ATCC29212),購自中國藥品生物制品檢驗所。

1.1.3 抗生素標準品 所用6種抗生素標準品均購自中國藥品生物制品檢驗所。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集了福州地區9個豬場飲用水的45份水樣;豬場內的采樣點主要包括水源進水口、蓄水池、懷孕舍飲水、分娩舍飲水、保育舍飲水及肥育舍飲水。每個采樣點收集2份平行水樣,用聚乙烯瓶密封,且每個采樣點采集水樣不小于1.0 L。采集的水樣盡量避免陽光照射,于4 ℃條件下保存,盡快送至實驗室,在24 h內處理完成。

具體采樣方法:(1)可以直接用聚乙烯瓶接水的采樣點:在接水前,先將飲水器打開，放去前段水10～20 s；然后用飲水器的流水將聚乙烯瓶潤洗兩遍；最后直接將聚乙烯瓶對準水流,隔空接水。(2)較難接觸到且不能直接用聚乙烯瓶采樣的點:用自制的水樣采集器直接浸入0.3～0.5 m處取水,然后將樣品注入聚乙烯瓶中,采樣時不應采到表面水；應將采樣器瓶口朝下浸入水中,將瓶傾斜,使瓶口微微向上，注意不能混入漂浮于水面上的物質；在采集完后,要對水樣進行標記,及時登記水樣信息表。

1.2.2 水樣的處理 用SHZ-Ⅲ型循環水真空泵將各點采集的水樣用0.22 μm濾膜過濾富集細菌,每次過濾水樣體積為300 mL。然后將濾膜放入2 mL MH滅菌肉湯中,并放置于搖床(37 ℃、190 r/min)增菌培養6 h。

1.2.3 腸球菌的分離純化 將增菌培養后的液體劃線接種于腸球菌選擇培養基,放置于恒溫(37 ℃)培養箱中培養24～48 h。可見培養基上長出紅色或粉紅色的圓形、潤滑菌落。然后挑取典型單菌落，將其接種于胰蛋白大豆營養瓊脂上增菌,在37 ℃下培養18～24 h。

1.2.4 腸球菌的鑒定

1.2.4.1 腸球菌的生化鑒定 取在胰蛋白大豆營養瓊脂上長出的單個白色圓形菌落,分別接種于pH 9.6的MH肉湯、含6.5%NaCl的MH肉湯、0.1%美藍牛奶中,于37 ℃恒溫培養18～24 h；另取菌落接種于高壓滅菌過的2 mL MH肉湯中，于搖床(37 ℃、191 r/min)培養6 h,觀察細菌生長情況，做初步判斷,待檢。

1.2.4.2 腸球菌的PCR鑒定 (1)水煮法提取細菌DNA:采用水煮法提取生化鑒定中合格的細菌DNA。首先,用接種環挑取解凍菌液，接種于裝有2 mL滅菌MH肉湯的試管中,于37 ℃培養18～24 h；再將試管中的菌液全部轉移到2 mL無菌離心管中,以12000 r/min離心2 min,棄去上清液；然后,往離心管中加入200 μL滅菌雙蒸水,沸水浴10 min,接著冰浴3 min；最后以8000 r/min離心5 min,取上清液,置于-20 ℃保存備用[11]。

(2)PCR反應:采用PCR法對分離純化得到的腸球菌進行腸球菌屬鑒定。以每個樣本不超過1株分離菌為原則。針對腸球菌屬的高度保守的tuf基因組片段設計特異性引物(Ent1、Ent2)來鑒定分離株的屬類，其中上游引物Ent1為5′-TACTGACAAACCATTCATGATG-3′，下游引物Ent2為5′-AATTCGTCACCAACGCGAAC-3′。目的擴增片段長度為112 bp,反應體系如表1所示。PCR反應條件:先在95 ℃下預變性3 min；然后在94 ℃下變性30 s,65 ℃退火45 s,72 ℃ 30 s,共30個循環；最后在72 ℃下延伸10 min。在電泳結束后,取出凝膠置于凝膠成像系統獲取圖像并保存,電泳的結果以500 bp的Maker為參照,將PCR產物出現目的亮帶112 bp的樣本菌株鑒定為腸球菌。

表1 PCR反應擴增體系

1.2.5 腸球菌的保存 將通過PCR方法鑒定為腸球菌屬的菌株接種于滅菌的2 mL MH肉湯中,置于搖床(37 ℃、190 r/min)培養6 h,在菌液中加入20%的甘油。每株菌保存兩份,分別放置于-20 ℃和-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.6 腸球菌藥敏實驗

1.2.6.1 微量肉湯稀釋法 采用微量肉湯稀釋法測定樣本腸球菌對6種抗生素的最小抑菌濃度(即MIC值)，嚴格根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的方法進行操作。

1.2.6.2 接種菌液的配制 把保存的實驗樣本菌株的甘油菌解凍,取20 μL甘油菌液于裝有2 mL滅菌MH肉湯的EP管中,放置于搖床(37 ℃、191 r/min)培養6 h。用紫外分光光度計測定上述菌液的OD600值。然后用MH肉湯稀釋菌液將其濃度調整到吸光度為0.08～0.10之間,即為0.5麥氏比濁[(1～2)×108CFU/mL]；在接種時再稀釋10倍,此時菌液濃度為107CFU/mL。

1.2.6.3 抗生素儲備液的配制 將抗生素制備成濃度為5120 μg/mL的儲存液；在使用前先用0.22 μm的滅菌濾膜除去細菌,再稀釋成各種所需要的濃度。抗生素儲存液的配制方法見表2。

1.2.6.4 藥敏實驗操作過程 藥敏實驗使用的是具蓋96孔U型板。首先,在96孔U型板上加入100 μL滅菌MH肉湯。其次,將抗生素儲存液稀釋10倍,在板上將其倍比稀釋成所需的11個濃度,分別是256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL；第12孔不加抗生素,設置為陰性或陽性對照孔。最后,在鋪好肉湯和抗生素的孔上加入10 μL濃度為107CFU/mL的菌液。將96孔U型板置于37 ℃恒溫箱培養18～24 h，然后觀察結果。每塊板的操作時間控制在15 min以內。

表2 各種抗生素儲存液的配制方案

1.2.6.5 藥敏實驗結果判定 在讀取所測試菌株的MIC值前,首先觀察每塊板的對照孔細菌生長情況是否良好,同時還須檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否受到污染以及質控菌株的MIC值是否在質控范圍內。MIC值即為肉眼觀察微量稀釋孔中的細菌生長完全被抑制時的最低抗菌藥物濃度。根據CLSI提供的判定標準(表3)來判定樣本菌對抗生素的耐藥程度。

表3 腸球菌稀釋法藥敏實驗解釋標準

1.2.6.6 統計學處理 采用Excel軟件統計處理腸球菌的藥敏實驗數據。

1.2.6.7 抗生素耐藥譜分析 本實驗分別以A、C、H、O、V、E代表氨芐西林、環丙沙星、氯霉素、土霉素、萬古霉素和紅霉素,用來表示分離菌對6種抗生素的耐藥譜情況,如:ACH譜型表示對氨芐西林、環丙沙星和氯霉素同時耐藥。

1.2.6.8 腸球菌多重耐藥情況分析 分別以1耐、2耐、3耐、4耐表示分離菌同時對1、2、3、4種抗生素耐藥；中介表示至少對1種抗生素不敏感；敏感則表示對6種抗生素都敏感。

2 結果與分析

2.1 腸球菌分離與鑒定結果

本實驗共采集了福州地區9個豬場的42株腸球菌。PCR鑒定的凝膠瓊脂電泳結果見圖1。

2.2 福州地區豬場飲用水腸球菌的藥敏實驗結果

從福州地區9個豬場飲用水中共分離得到42株腸球菌,這些分離菌對6種抗生素的耐藥情況見表4。

圖1 PCR鑒定的凝膠瓊脂電泳圖

總體上,分離菌對抗生素的耐藥情況表現為土霉素>紅霉素>氯霉素>環丙沙星>氨芐西林>萬古霉素,耐藥率分別為80.95%、66.67%、35.71%、19.05%、16.67%、14.29%?？梢?分離菌對土霉素和紅霉素的耐藥率居前2位；對萬古霉素的耐藥率最低,耐藥率為14.29%。

表4 福州地區豬場飲用水腸球菌對6種抗生素的藥敏實驗結果 %

注:“R”表示耐藥;“I”表示中介;“S”表示敏感;各采樣點藥敏比率表示在每個采樣點內,分離菌的藥敏表型占對應采樣點分離菌數的比率;總藥敏比率指所有采樣點分離菌的藥敏表型占所有分離菌(42株)的比率。

從不同采樣點的耐藥情況來看:(1)水池進水口分離菌對抗生素的耐藥情況:土霉素>紅霉素>萬古霉素>氯霉素>環丙沙星=氨芐西林,耐藥率分別為77.78%、55.56%、33.33%、22.22%、11.11%、11.11%;分離出3株VRE;(2)蓄水池分離菌對抗生素的耐藥情況:土霉素>紅霉素>氯霉素>萬古霉素=氨芐西林,耐藥率分別為87.50%、50.00%、25.00%、12.50%、12.50%,沒有檢測到耐環丙沙星的腸球菌;分離出1株VRE;(3)保育舍飲水分離菌對抗生素的耐藥情況:土霉素=紅霉素>氯霉素>氨芐西林=環丙沙星,耐藥率分別為77.78%、77.78%、66.67%、44.44%、44.44%,沒有分離出VRE;(4)育肥舍飲水分離菌對抗生素的耐藥情況:土霉素=紅霉素>氯霉素>環丙沙星>萬古霉素,耐藥率分別為75.00%、75.00%、37.50%、25.00%、12.50%,沒有分離到耐氨芐西林的腸球菌;分離出1株VRE;(5)母豬舍飲水分離菌對抗生素的耐藥情況:土霉素>紅霉素>氯霉素>氨芐西林=環丙沙星=萬古霉素,耐藥率分別為87.50%、75.00%、25.00%、12.50%、12.50%、12.50%;分離出1株VRE。

2.3 福州地區豬場飲水腸球菌對6種抗生素的耐藥譜

由表5可知,福州地區9個豬場飲水腸球菌有11種耐藥譜,進水口、水池、保育舍飲水、育肥舍飲水、分娩舍飲水腸球菌的耐藥譜類型分別有5、4、6、6、5種；總體上,耐藥譜以HOE、OE、O為主,分別占分離菌總數(42株)的16.67%、14.29%、14.29%。發現有11株分離菌對4～5種抗生素耐藥,耐藥譜為AHOVE、AOVE、ACOE、CHOE,其中有5株是由保育舍飲水得到的。

2.4 福州地區豬場飲用水腸球菌的多重耐藥情況

由圖2可知,福州地區9個豬場飲水分離腸球菌具有1～5重耐藥的情況均有出現,具體如下:(1)進水口分離菌存在1、3、4重耐藥,以3重耐藥為主,沒有敏感菌和2重耐藥菌,2重以上的耐藥率為66.66%;(2)水池分離菌存在1、2、3、5重耐藥,以1耐、2耐為主,有敏感菌,沒有中介、4耐菌,2重以上的耐藥率為50.00%;(3)保育舍飲水分離菌1～5重耐藥均有存在,以3、4、5重耐藥為主,沒有敏感菌、中介菌,2重以上的耐藥率為88.89%;(4)育肥舍飲水分離菌存在2、3、4重耐藥,以3重耐藥為主,沒有敏感菌、5耐菌,2重以上的耐藥率為75.00%;(5)分娩舍飲水分離菌存在2、3、4重耐藥,以2、4重為主,沒有敏感菌、5耐菌,2重以上的耐藥率為75.00%。

表5 福州地區豬場飲用水腸球菌的耐藥譜

注:“/”表示采樣點分離菌沒有對應的耐藥譜;“比率”指具有相同耐藥譜的分離菌株數占所有分離菌(42株)的比率。

圖2 福州地區豬場飲用水腸球菌的多重耐藥情況

3 討論

在本實驗中，豬場飲用水分離菌主要對土霉素、紅霉素、氯霉素、環丙沙星的耐藥率較高。這與卓鴻璘[8]于2007年對3個豬場的不同年齡段的豬只肛門采樣以及豬場環境的糞腸球菌的耐藥情況調查結果一致。四環素類和大環內酯類的藥物在豬場常常用于預防和治療豬的疾病,還經常將其作為飼料添加劑使用。本實驗結果表明,豬場飲用水的分離菌對土霉素和紅霉素的耐藥情況較嚴重,今后在臨床上應盡量少用或不用。氯霉素早已被禁止用作飼料添加劑,但是分離菌對其表現出較高的耐藥率,這可能與氯霉素類抗菌素氟苯尼考在豬場的廣泛使用有關。

觀察每個豬場的5個采水點分離菌的耐藥情況,總體上有兩種現象:一是,水源或水池的分離菌對抗生素敏感或者只耐1種抗生素(土霉素或紅霉素),但是保育舍、分娩舍、育肥舍飲水中的分離菌幾乎都表現出多重耐藥;二是,水池或水源、保育舍、懷孕舍、分娩舍、育肥舍的飲水分離菌都表現為多重耐藥。第一種現象可能是因為豬場的水源并沒有耐藥菌或多重耐藥菌,或者水池得到了定期清洗,但是豬場飲水給藥的方式導致耐藥菌會在蓄水池之后的管道里殘留并繁殖。第二種現象可能是因為水源已經存在耐藥菌,或者水池不常清洗,導致耐藥菌大量增加,進而導致輸水管道也有耐藥菌繁殖增長。

養殖場抗生素的給藥方式主要有飼料添加、飲水添加及肌肉注射三種,其中飲水及飼料添加等低濃度給藥方式已被證明是最容易導致細菌產生耐藥性的給藥方式。因此本研究重點考察豬場水源飲用水以及飲水器飲用水耐藥腸球菌的差異,我們發現福建省豬場目前水源飲用水耐藥率明顯低于飲水器飲用水,表明該省豬場目前的飲水管網普遍存在耐藥細菌污染的情況,應該引起高度關注。據了解,目前國外養殖場普遍有對飲水管網進行清洗的習慣,清洗頻率通常為每個月一次。而國內養豬場幾乎沒有清洗管網的習慣,長期未清洗的管網容易形成生物膜,而生物膜耐藥是細菌耐藥的重要機制之一；加上有些管網比如保育舍的飲用水管網經常添加抗生素和抗應激劑等產品,致使其中的耐藥細菌更容易被誘導和選擇出來,因此,本實驗中的豬場飲水器飲用水普遍存在高比率的耐藥腸球菌,其中保育舍飲水器腸球菌耐藥水平最高。以上結果提醒我們對國內豬場飲水器進行定期清洗的重要性和迫切性。

本實驗發現,某些豬場源頭飲用水就存在腸球菌耐藥嚴重的現象,提示這些豬場的源頭飲用水存在被地表水污染的可能。在美國,有專家提出可以用水中細菌耐藥的模式ARP來指示水體污染的來源；建議以上豬場的管理者尋找污染的來源,并及時改進。在本實驗中我們還發現普遍存在水源進水口的腸球菌耐藥情況比蓄水池要好的現象,這可能與國內豬場普遍忽視蓄水池的管理和清洗有關；同時,有些豬場在蓄水池中使用消毒劑,可能也是選擇出更多耐藥菌的原因。

[1] Poh C H, Oh H M L, Tan A L. Epidemiology and clinical outcome of enterococcal bacteraemia in an acute care hospital [J]. Journal of Infection, 2006, 52(5): 383-386.

[2] 潘尋,韓哲,李浩.抗生素在畜禽養殖業中的應用、潛在危害及去除[J].農業環境與發展,2012,29(5):1-6.

[3] 瞿婷婷,俞云松,孫自鏞,等.2011年中國CHINET腸球菌屬細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2013,13(5):337-341.

[4] 楊青,俞云松,倪語星.2009年中國CHINET腸球菌屬細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志,2010,10(6):421-425.

[5] Chen B W, Yuan K, Chen X, et al. Metagenomic analysis revealing antibiotic resistance genes (ARGs) and their genetic compartments in the Tibetan environment [J]. Environ Sci Technol, 2016, 50(13): 6670-6679.

[6] Haley S, Colin F, Brown R S, et al. Antibiotic resistance genes as an emerging environmental contaminant [J]. Environmental Reviews, 2016, 24(2): 205-218.

[7] 陳杖榴,吳聰明,蔣紅霞,等.獸用抗菌藥物耐藥性研究[J].四川生理科學雜志,2003:120-123.

[8] 卓鴻璘.動物源糞腸球菌耐藥性流行病學研究[D].福州：福建農林大學,2007.

[9] Byappanahalli M N, Nevers M B, Korajkic A, et al. Enterococci in the environment [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2012, 76(4): 685-706.

[10] Thomas D J I, Morgan J A W, Whipps J M, et al. Plasmid transfer betweenBacillusthuringiensissubsp.israelensisstrains in laboratory culture, river water, and dipteran larvae [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(1): 330-338.

[11] 默里,巴倫,等.臨床微生物學[M].徐建國,梁國棟,等.譯.北京:科學出版社,2005:407-409.

(責任編輯:黃榮華)

Difference Study on Antibiotic-resistant Characters ofEnterococcusfrom Original Water and Pipe-network Water of Pig Farms

LIN Yun-qin1, ZENG Zhong-hua2, CHEN Ru-deng3

(1. Animal Husbandry and Veterinary Center of Fuqing City in Fujian Province, Fuqing 350100, China; 2. Animal Disease Prevention and Control Center of Zhangzhou City in Fujian Province, Zhangzhou 363000, China; 3. Agricultural Product Quality and Safety Inspection and Testing Center of Fujian Province, Fuzhou 350000, China)

A total of 42Enterococcusstrains were isolated from the original water and pipe-network water of 9 pig farms in Fuzhou area, and the minimal inhibitory concentrations (MIC) of these strains to 6 kinds of antibiotics were detected by using micro-broth dilution method. The research results showed that the resistant rate of 42 strains to oxytetracycline, erythrocin, chloromycetin, ciprofloxacin, ampicillin and vancomycin was 80.95%, 66.67%, 35.71%, 19.05%, 16.67% and 14.29%, respectively. The isolates from water inlet of pool and impounding reservoir had a slightly lower resistant rate to oxytetracycline and erythrocin than those from drinking bowl, while they had a significantly lower resistant rate to chloromycetin, ciprofloxacin and ampicillin than those from drinking bowl. The isolates from the drinking bowl in piglet-care house had a higher resistant rate to all antibiotics. The isolatedEnterococcusstrains had 11 types of antibiotic-resistant spectrum; eleven strains were resistant to 4～5 kinds of antibiotics, and 5 strains of them were isolated from the drinking bowl in piglet-care house. The isolates from water inlet of pool and impounding reservoir had a lower multiple resistant rate than those from drinking bowl, and the isolates from the drinking bowl in piglet-care house had the highest multiple resistant rate.

Pig farm; Drinking water;Enterococcus; Antibiotic; Resistance; Drinking-water pipe network

2017-04-02

林云琴(1972—)，福建福清人，畜牧師，研究方向：畜牧、畜禽飼料及飼養管理。

S852.6

A

1001-8581(2017)08-0099-06