不同品種澳洲堅果花粉生活力的研究

羅立娜，韓樹全，范建新，王代谷，劉 榮，黃 海，吳小波

(貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400)

不同品種澳洲堅果花粉生活力的研究

羅立娜，韓樹全，范建新*，王代谷，劉 榮，黃 海，吳小波

(貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400)

為了比較不同品種澳洲堅果花粉的生活力，篩選適合的檢測方法，以6個澳洲堅果品種的新鮮花粉為材料，并用形態測定法、聯苯胺染色法和藍墨水染色法3種方法測定花粉生活力，結果表明：在顯微鏡下觀察，澳洲堅果花粉粒均呈現三角形或近三角形，顏色呈灰色或灰褐色。其中，形態測定法是根據花粉的形狀來檢測生活力，準確性低；藍墨水染色法染色后顏色不易分辨，不適合澳洲堅果花粉生活力檢測；聯苯胺染色法測定澳洲堅果花粉生活力效果最佳，不同品種澳洲堅果的花粉萌發率在72.50%～90.63%之間，其中以Kau的花粉生活力最高。因此，推薦聯苯胺染色法是測定澳洲堅果花粉生活力的較簡單、快速、準確的方法。

澳洲堅果；花粉生活力；形態測定法；聯苯胺染色法；藍墨水染色法

澳洲堅果(Macadamiaternifolia)是山龍眼科澳洲堅果屬的多年生常綠果樹，又名夏威夷果、昆士蘭栗、澳洲胡桃，原產于澳大利亞昆士蘭和新南威爾士的亞熱帶雨林地區。目前，主產國分布在澳大利亞、南非、美國、肯尼亞、中國等[1-4]。澳洲堅果果仁具有奶油香味、口感酥脆，脂肪酸含量高達60%～80%，含有多種微量元素、維生素等物質，具有很高的營養價值，有著“世界堅果之王”的美譽[5-9]。目前，在我國熱區迅猛發展，應用前景廣闊。

花粉質量的好壞、生活力的強弱是直接影響坐果率的重要因素[10]，花粉生活力弱，有效授粉率低，會影響果樹的產量。澳洲堅果每年開花量大，但授粉過程中存在自交不親和性，且不同品種間的花期不一致，導致坐果率下降，產量受到影響。為了研究澳洲堅果新鮮花粉生活力的強弱，本文對6個澳洲堅果品種的花粉生活力進行了分析，以篩選澳洲堅果花粉生活力測定的最佳方法，同時研究了不同品種花粉生活力的差別，為澳洲堅果的授粉、花粉貯藏、雜交育種等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自于貴州省亞熱帶作物研究所望謨科技示范園澳洲堅果基地，供試品種有Kau(344)、Pahaha(788)、Own Choice(O.C)、H2、桂熱1號、695，園地條件一致，設施完善，植株長勢健壯。在盛花期上午10：00～12：00采集即將開放的整朵花序，迅速帶回實驗室后，輕輕抖動使花粉從花藥中散出，置于培養皿中，待花粉自然干燥后收集于塑封袋中，放于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗藥劑及方法

1.2.1 試驗所用藥劑及儀器 試驗所用試劑：藍墨水、聯苯胺、α-萘酚、碳酸鈉、過氧化氫(表1)，儀器包括顯微鏡、培養皿、鑷子等。

表1 試驗藥劑

1.2.2 形態測定法 形態測定法的基本原理是根據花粉大小、形狀、顏色來判斷花粉生活力。首先在載玻片上滴蒸餾水1～2滴，用頭發絲蘸取少量花粉放入蒸餾水中，蓋上蓋玻片5 min后在10×顯微鏡下觀察花粉的形狀、顏色等特征。有生活力的花粉表現為大小均勻、形狀規則、內含物飽滿，而發育不正常的花粉則大小不齊、形狀各異、遇水容易破裂。觀察3個不同視野，每個視野花粉粒總數在70粒以上，計算有生活力花粉粒與花粉總數之比，計算公式如下：

花粉生活力/%=(有生活力花粉粒數/總花粉粒數)×100%

1.2.3 聯苯胺染色法 聯苯胺染色法又稱過氧化物酶染色法，其原理是根據所用試劑與花粉中的過氧化物酶發生氧化反應而染色。第一步，稱取0.1 g聯苯胺溶于50 mL濃度為50%的酒精中；第二步，稱取0.075 g α-萘酚溶于50 mL濃度為50%的酒精中；第三步，稱取0.125 g碳酸鈉溶于50 mL蒸餾水中；第四步，配置0.3%過氧化氫溶液，盛于棕色瓶放于冰箱內保存備用。

檢測方法：先將聯苯胺溶液、α-萘酚溶液、碳酸鈉溶液按等量配制成混合液，在載玻片加1滴混合液和1滴過氧化氫溶液，用頭發絲蘸取少量花粉放入混合液中，蓋上蓋玻片靜置15 min后，在10×顯微鏡下觀察。凡具有生活力的花粉都被染上紅色，無生活力的花粉則無色；觀察3個不同視野，每個視野花粉粒總數在70粒以上，計算被染上紅色花粉粒與總花粉粒數之比，計算公式如下：

花粉生活力/%=(充實飽滿花粉數/總花粉數)×100%

1.2.4 藍墨水染色法 在載玻片上滴入一滴蒸餾水，再加一滴藍墨水溶液，用鑷子攪拌均勻，用頭發絲蘸取少量花粉放入溶液中，蓋上蓋玻片5 min后置于10×顯微鏡下觀察。花粉粒呈無色時表示具有生活力，呈藍黑色為無生活力或發育不良的花粉。觀察3個不同視野，每個視野花粉粒總數在70粒以上，求其平均值，統計花粉的生活力，計算公式如下：

花粉萌發率/%=(無色花粉粒數/總花粉粒數)×100%

1.3 數據分析

采用Excel 2003軟件對試驗數據進行整理和分析，SigmaPlot 10.0進行繪圖，SAS 9.1.3軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 形態觀測法澳洲堅果花粉生活力的測定

在10×和40×顯微鏡下觀察，澳洲堅果的花粉粒均呈現三角形或近三角形，顏色呈灰色或灰褐色(圖1)，表1顯示了形態觀測法測得澳洲堅果花粉生活力的結果。不同品種的澳洲堅果的花粉活力均在80%以上，由強到弱依次為H2、344、桂熱1號、788、O.C、695；其中H2的花粉生活力最高，達到87.96%；695的花粉生活力最低，為84.53%。澳洲堅果的花粉生活力顯著性分析見圖2，結果表明：形態觀測法測澳洲堅果不同品種間花粉生活力差異不顯著。

圖1 10×和40×顯微鏡下澳洲堅果花粉的形態

品種視野花粉總數/個有活力花粉/個無活力花粉/個花粉生活力/%平均花粉生活力/%O．C180691186．2521271091885．83395801584．2185．43H2175651086．67279681186．0837972791．1487．96344199871287．8821331122184．2137466889．1987．0978817768988．3121581322683．543105891684．7685．54桂熱1號11421231986．6221581362286．083107921585．9886．23695191781385．71291751682．4231651412485．4584．53

圖2 形態觀測法測澳洲堅果花粉生活力的顯著性分析

2.2 聯苯胺染色法澳洲堅果花粉生活力的測定

由表3可以看出，在澳洲堅果不同品種中，花粉生活力變化范圍在72.50%～90.63%之間，與形態觀測法結果略有差異，花粉生活力最強的是344，為90.63%；其余依次為H2、桂熱1號、788、695、O.C，花粉生活力分別為87.44%、85.99%、85.03%、77.46%、72.50%。由圖3可以看出，花粉生活力較強的344、H2、桂熱1號、788之間差異不顯著，而344、H2與花粉生活力較弱的O.C、695差異顯著(P<0.01)。

2.3 藍墨水染色法澳洲堅果花粉生活力的測定

由表4可知，不同品種澳洲堅果花粉生活力在0.2%～1.5%之間，最高的是344，但花粉生活力僅1.5%。由此可知，藍墨水染色法不適用于澳洲堅果花粉生活力的檢測。

3 討論

花粉活性檢測是解決植物不同品種間的花期不遇、雜交育種困難等問題必不可少的基礎性工作[11-13]。目前，國內對于澳洲堅果花粉生活力的研究較少，林玉虹等[14]以澳洲堅果O.C、788、800這3個品種為試材，研究了花粉活力和柱頭可授性，結果發現：同一品種不同時間開放的小花柱頭的可授性差異較大，前3 d不同品種小花的花粉活力差異極顯著。王麗娜等[15]研究了水分脅迫對澳洲堅果花粉生活力和貯藏性的影響，結果表明：澳洲堅果花粉生活力測定最適合的方法是聯苯胺染色法，不同品種間的貯藏性由強到弱依次為Kau>Pahala>O.C。楊帆等[16]以13年生澳洲堅果為試材研究花粉的最佳保存方式，發現以自然干燥2 h，保存5 d的花粉萌發率最大，同時采用瓊脂培養基法測定花粉生活力為42.24%。

表3 聯苯胺染色法測澳洲堅果花粉生活力的結果

圖3 聯苯胺染色法測澳洲

表4 不同澳洲堅果品種花粉生活力的比較 %

本文應用形態觀測法、聯苯胺染色法、藍墨水染色法，測定了不同品種澳洲堅果的花粉生活力，結果表明：澳洲堅果花粉呈現三角形或近三角形，發育不良的花粉形狀不規則，顏色灰白色。形態觀測法測定澳洲堅果花粉生活力的操作方法簡單，主要是通過花粉的大小、形態間的差異判斷生活力的有無，結果的準確性較差。通過形態觀察法觀測澳洲堅果不同品種間花粉生活力變化不大，均在84.53%～87.96%之間，且差異不顯著。

利用染色法測定花粉的生活力，方法簡單快速，能在一定程度上反映花粉內部的代謝情況或營養含量，但方法受花粉壁的薄厚、質膜的完整性、細胞質含量及花粉內各種酶活性的強弱等因素的影響，因此，不同的染色方法并非對所有的植物花粉都適用[17-18]。聯苯胺染色法測澳洲堅果花粉生活力速度快，顏色易于分辨，結果較可靠，該結果與楊帆等[16]的研究結果一致。本研究結果顯示，不同品種花粉生活力值在72.50%～90.63%之間，表現出較高的生活力，但不同品種間存在明顯的差異，花粉活力大小依次為344>H2>桂熱1號>788>695>O.C。其中生活力較高的有344、H2，且與生活力較低的695、O.C呈顯著性差異，這可能與不同種質的遺傳特性或者不同樹體的營養狀況有關。藍墨水染色法測澳洲堅果花粉生活力存在染色不均勻、與背景顏色難以區分等問題，結果不理想，不適用于檢測澳洲堅果花粉的生活力。因此，本研究最終篩選出聯苯胺染色法是測定澳洲堅果花粉生活力的較簡單、快速、準確的方法。

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(責任編輯：曾小軍)

Study on Pollen Viability of Different Macadamia Varieties

LUO Li-na, HAN Shu-quan, FAN Jian-xin*, WANG Dai-gu, LIU Rong, HUANG Hai, WU Xiao-bo

(Guizhou Institute of Subtropical Crops, Xingyi 562400, China)

In order to compare the pollen viability of different varieties of macadamia, and to screen out a suitable determination method, we determined the fresh pollen viability of six macadamia varieties by using morphometry method, benzidine coloration method and blue ink coloration method. The results indicated that: under a microscope, the pollen grains of macadamia were triangular or nearly triangular, and were gray or grayish brown in color. The morphometry method detected the pollen viability according to the shape of pollens, and had a low accuracy. The blue ink coloration method was not suitable for the determination of pollen viability of macadamia because it could not easily distinguish the pollen color after coloration. The benzidine coloration method had the best effect in the determination of pollen viability of macadamia. The pollen germination rate of different varieties of macadamia was 72.50%～90.63%, and the variety Kau had the highest pollen viability. Therefore, the benzidine coloration method was recommended as a simple, rapid and accurate method for measuring the pollen viability of macadamia.

Macadamia; Pollen viability; Morphometry method; Benzidine coloration method; Blue ink coloration method

2017-06-06

貴州省農業科學院項目(黔農科院院專項[2013]021號)；貴州省農業科學院項目(黔農科院自主創新科研專項字[2014] 001號)；貴州省科研機構服務企業行動計劃(黔科合服企[2015]4002號)。

羅立娜(1991─)，女，研究實習員，碩士，研究方向：植物栽培與生理。*通訊作者：范建新。

S664.9

A

1001-8581(2017)08-0034-04