艾炷灸抗哮喘小鼠氣道炎癥機制研究

謝玲玲，李品純，潘鳳霞，朱北勝，李 梅

(崇左市人民醫院中醫康復科， 廣西 崇左 532200)

【針灸研究】

艾炷灸抗哮喘小鼠氣道炎癥機制研究

謝玲玲，李品純，潘鳳霞，朱北勝，李 梅

(崇左市人民醫院中醫康復科， 廣西 崇左 532200)

目的：通過觀察艾炷灸對哮喘模型小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)水平的影響，探討其抗哮喘氣道炎癥的作用機制。方法：昆明種小鼠32只按隨機數字表法分為空白組、哮喘模型組、艾炷灸治療組、硫酸特布他林(Terbutaline Sulfate,TS)陽性組，空白組用生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，其余各組采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化激發哮喘，哮喘模型制作成功后，分別利用生理鹽水霧化、TS霧化液、艾炷灸進行治療，2周后測小鼠血清的MDA、SOD、NO值，觀察對比各組肺組織形態。結果： 與空白組比較，哮喘模型組小鼠血清MDA、NO水平顯著增高；與哮喘模型組比較，TS陽性組、艾炷灸治療組的MDA水平顯著降低；與空白組比較，哮喘模型組小鼠血清SOD水平顯著降低；與哮喘模型組比較，TS陽性組、艾炷灸治療組的SOD水平顯著增加。結論: 艾炷灸能明顯抑制哮喘小鼠氣道炎癥，其機制可能與其降低機體NO、MDA水平，增強SOD的活力有關。

哮喘；艾炷灸；氣道炎癥；抗氧化

中醫認為，哮喘是由于寒邪傷肺、肺腎兩虛等導致痰氣交阻、阻塞氣道、肺氣升降不利進而出現呼吸困難、氣息喘促[1]。艾灸是利用灸火溫熱性給予人體溫熱刺激，滲透入經絡腧穴，是治療和防治疾病的一種方法，其溫經散寒、活血通絡、扶陽固脫是中醫學治療哮喘的常用治療方法。臨床觀察發現，艾灸不僅對改善肺通氣功能有顯著效果，而且能調節機體免疫功能，對于變態反應性疾病和氣道反應性疾病有很重要的作用，并能有效控制哮喘發作[2]。

本實驗利用小鼠復制哮喘模型，使用艾炷灸對哮喘小鼠進行治療，觀察肺組織病理形態學改變，并對比小鼠血清MDA、SOD、NO水平，從而分析艾炷灸抗哮喘模型小鼠氣道炎癥機制。

1 資料與方法

1.1 動物與分組

選取廣西中醫藥大學實驗動物中心提供的昆明種小鼠32只,體質量16～23 g,雌雄各半。正常飼養1周后按隨機數字表法分為空白組、哮喘模型組、TS陽性組、艾炷灸治療組各8只，雌雄各半。

1.2 主要試劑與儀器

超聲霧化器980型、AS620型冰凍切片機、MaticB5型雙目生物顯微鏡、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、卵清白蛋白OVA、一氧化氮(NO)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、TS霧化液、精制艾絨。艾炷制備： “熱敏灸條”中艾絨制作成直徑為3 mm、高4 mm、重約13～15 mg的圓錐體艾炷；TS霧化液制備：TS液2.5 mg加入1 ml生理鹽水。

1.3 小鼠哮喘模型復制

第1、8、15天分別給哮喘模型組、TS陽性組、艾炷灸治療組每只小鼠腹腔注射抗原液0.5 mL以致敏，空白組用生理鹽水代替，每日1次。從第16天開始，將哮喘模型組、TS陽性組、艾炷灸治療組小鼠分別置于25 cm×15 cm×15 cm密閉玻璃容器內，給予1%OVA引喘液恒壓超聲霧化吸入激發。空白組以等量生理鹽水進行霧化激發，每日1次，每次霧化吸入20 min共14d。

1.4 治療方法

從第16天起每次霧化前30 min做治療。艾炷灸治療：用固定夾將小鼠固定后參照李辭蓉等著的《小鼠針灸穴位圖譜的研制》標準及擬人比照法進行穴位定位。艾炷施灸方法: 先將施灸部位的體毛剪去,再涂以少量蘆薈汁放上艾炷, 采用無瘢痕直接灸,每穴3壯，每日1次，每壯以小鼠全身掙扎為度。艾炷灸治療組分別于第17、19、21、23、25、27、29天奇數天艾炷灸中脘、膻中。偶數天從第16天至第30天艾炷炷灸雙肺腧。TS陽性組治療：TS溶液霧化治療，每日1次，每次霧化20 min共14 d。空白對照組：哮喘模型組第16天開始介入，以生理鹽水代替霧化治療，每日1次，每次霧化20 min共14 d。

1.5 血清SOD、MDA、NO檢測

第30天(末次霧化激發24 h后)將各組小鼠眼球取血2 mL,然后以3 000 r/min的速度離心10 min取血清，放置低溫冰箱中備用。SOD、MDA、NO檢測方法按照說明書進行。

1.6 病理切片

處死小鼠，用磷酸鹽緩沖液經支氣管灌注后取下右肺葉，以10%福爾馬林固定24 h后作病理切片，行HE染色作病理觀察。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠行為學觀察

空白組：吸入生理鹽水霧化液后小鼠開始有輕度搔鼻抓面等舉動，個別小鼠有噴嚏現象，但無咳嗽、氣促等癥狀，3～5 min后逐漸適應，上述表現全部消失，活動雖減少但呼吸平穩，神態安定，無任何呼吸道癥狀。激發過后小鼠迅速恢復活動且活動敏捷，食量正常，體質量增加，毛色光澤。哮喘模型組: 小鼠在吸入1%OVA30 s～1 min后即出現明顯煩躁不安，不停搔抓鼻面及全身，噴嚏、咳嗽繼而活動減少，拱背蜷臥，呼吸急促、深快，腹部收縮凹陷，鼻部、唇周皮膚發紺、舌質紫黯等。部分小鼠出現呼吸不規則，反復激發后上述癥狀逐漸加重。激發過后精神較差，食量減少，體質量增長速度減慢，毛發欠光澤。其余各給藥組小鼠在激發時也出現搔抓鼻面、噴嚏、咳嗽及呼吸增快、腹部收縮等癥狀，但持續時間短，頻率和程度均較輕；TS陽性組: 出現食量減少，逐漸消瘦，體質量下降，少量脫毛且毛發欠光潤，激發時煩躁多動，口唇、鼻周見輕度紫紺等癥狀；艾炷灸治療組：小鼠吸入OVA后其表現未見紫紺及煩躁不安等癥狀，激發過后精神、活動、食量、體質量及毛發無明顯異常。

2.2 肺組織病理形態學觀察

空白對照組(見圖1)：小鼠肺組織中肺泡壁薄，肺泡的大小均一，肺泡腔內無任何分泌物滲出，肺泡的間隔無增寬，肺無萎陷及血管壁增厚，支氣管黏膜皺壁無任何破壞，支氣管壁及其周圍無炎性細胞浸潤和分泌物；哮喘模型組：肺泡壁結構被破壞，顯著的炎癥變化，肺泡腔內滲出物明顯增多，支氣管收縮，管壁黏膜下水腫，支氣管黏膜上皮局部脫落，基底膜增厚，玻璃樣變性，杯狀細胞增生，支氣管周圍血管擴張、充血，管壁各層明顯的嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞浸潤；TS陽性組：TS陽性組輕度炎癥變化，相較于哮喘模型組其炎性細胞浸潤明顯減輕，黏液減少，肺泡結構及支氣管黏膜完整，部分仍有輕微破壞。但總體來說，TS陽性組病變范圍、程度均較模型組減輕；艾炷灸治療組：支氣管結構基本正常，個別黏膜細胞變性及壞死，支氣管腔內未見明顯炎性滲出物，管腔周圍有少量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤；肺泡壁輕度增寬，毛細血管擴張充血明顯減輕，肺泡壁少量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，肺泡腔內未見炎性滲出物。組織學改變與TS陽性組類似，與哮喘模型組比較炎癥程度明顯減輕。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片(×500)

2.3 各組小鼠血清MDA、SOD、NO水平比較

表1顯示，哮喘模型組與空白組比較，血清MDA、NO水平顯著增高(P<0.05)，血清SOD活性顯著降低(P<0.01)；TS陽性組和艾炷灸治療組與哮喘模型組比較，血清MDA、NO水平顯著降低(P<0.01)，血清SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)；TS陽性組血清MDA、SOD、NO水平與艾炷灸治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)；艾炷灸治療組與空白組血清MDA、SOD、NO水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠血清MDA、SOD、NO水平比較

注：與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01;與哮喘模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

本研究發現，哮喘模型組哮喘血清SOD水平顯著降低,MDA水平顯著增高，說明哮喘小鼠體內氧自由基增多，清除氧自由基的SOD減少，生成的脂質過氧化物MDA增加。國內學者研究證實，在哮喘發作過程中給予抗氧化劑可以明顯改善哮喘臨床癥狀，縮短病程[3]。本實驗結果顯示，模型組小鼠肺組織SOD活性顯著下降而MDA水平顯著增加，說明小鼠體內產生了大量氧自由基，與近年來有關氧自由基在哮喘中作用的報道相一致[4]。經過艾炷灸干預后，艾灸組小鼠血清SOD活性升高，MDA水平降低，與正常組比較差異無統計學意義，基本恢復正常活性。說明艾炷灸可以提高哮喘小鼠體內SOD活性，增強抗氧化能力，對體內產生的過量氧自由基有清除作用。

NO對淋巴細胞增生有抑制作用，并發揮其抗炎作用[5]。但如果氣道組織中的iNOS不斷被激活，其合成并釋放出大量的NO刺激呼吸道毛細血管后靜脈漿細胞，致使漿細胞的滲出物增多，上皮細胞大量脫落，功能結構變性，導致細胞最終死亡，從而使炎癥反應更為嚴重，氣道反應性明顯增高，哮喘癥狀則加速惡化[6]。Ward等[7]通過研究發現，NO供體可抑制乙酞膽堿、組胺、白三烯D4所致的氣道收縮，NOS抑制劑L- NAME可減弱由于冷空氣、運動所引起的氣道收縮，但不影響乙酰膽堿釋放，提示NO對乙酞膽堿收縮氣道平滑肌起著對抗作用。正常情況下，cNOS來源的NO可以松弛各個氣管的氣道平滑肌，對氣道平滑肌張力的正常生理調節發揮著重要作用。當哮喘時，源于cNOS生成而來的NO不足，氣道上的非腎上腺素能非膽堿能神經功能發揮失常，導致iNOS活性增強，局部氣管組織周圍產生大量的NO，一旦氣道組織受損立即誘發氣道高反應性。本研究發現，哮喘模型組血清NO水平濃度顯著高于空白組，說明哮喘模型組小鼠血清及氣道平滑肌周圍產生大量NO，并誘發氣道高反應，符合哮喘發病的重要特征。經TS及艾炷灸治療后哮喘小鼠血清NO大幅下降，與哮喘模型組比較差異顯著。上述研究表明，艾炷灸與TS一樣具有抑制炎癥、緩解控制哮喘發作的功效，提示艾炷灸抗氣道炎癥的作用機制與氣道高反應密切相關。由此可知，艾炷灸可以抗氧化，清除哮喘模型體內自由基，使之免受哮喘發病過程中脂質過氧化物的損傷。

〔1〕 王永炎.中醫內科學[M].上海:上海科學技術出版社,1997:62- 68.

〔2〕 唐照亮,宋小鴿,章復清,等.艾灸抗炎免疫作用機制的實驗研究[J].安徽中醫學院學報,2003,22(2):35.

〔3〕 符州,等.大劑量維生素C、E治療哮喘[J].實用兒科臨床雜志，1997,12 (6):384- 385.

〔4〕 杜捷夫,等.哮喘患者及豚鼠模型血漿肺組織內皮素- 1測定及亞硝基左旋精胺酸甲酷的影響[J].中華結核和呼吸雜志,1998, 21 (5):293- 296.

〔5〕 王水利.一氧化氮在哮喘發病中的作用[J].醫學綜述,2000,6(4):162.

〔6〕 杜捷夫.一氧化氮在支氣管哮喘發病及治療中的作用[J].國外醫學:內科學分冊,1996,23(8):330.

〔7〕 SILKOFF PE, ERZURUM SC, LUNDBERG JO, et al.ATS Workshop proceedings: exhaled nitric oxide and nitric oxideoxidative metabolism inexhaled breath condensate[J].Proc Amthorac Soc,2006,3(2): 131- 145.

Study on the Curing Mechanism of the Airway Inflammation with Moxa Cone Moxibustion in Murine of Asthma

XIE Ling- ling, LI Ping- chun, PAN Feng- xia, ZHU Bei- sheng, LI Mei

(The Department of rehabilitation medicine, People’s Hospital of Chongzuo,Guangxi,Chongzuo 533200,China)

Objective: To observe the effective of moxa cone moxibustion on serum superoxide dismutase activity, nitric oxide and malondialdehyde in rats with asthma in order to explore its possible effective mechanism during the process of cure the asthma.Methods: Thirty- two rats were randomly divided into control group, asthma model group, moxibustion treatment group, terbutaline sulfate positive group and blank group with saline intraperitoneal injection and aerosol inhalation, the other groups were given intraperitoneal injection of ovalbumin sensitization and inhalation asthma, after the success of modeling respectively. Using saline atomization, atomization, TS moxibustion treatment, measured two weeks after the mice serum MDA, SOD, NO, lung morphology observation;Results: Compared with the control group, asthma model group serum MDA, NO levels increased significantly; Compared with the asthma model group, TS positive group, moxibustion treatment group MDA was significantly lower. Compared with the control group, asthma model group serum SOD levels were significantly reduced;Compared with the asthma model group, TS positive group, Moxibustion treatment group the level of SOD was significantly increased; Conclusions: Moxa cone moxibustion can increase the activity of SOD in serum of mice, decrease NO, MDA level, therefore, possible mechanism of moxa cone moxibustion on asthma and decrease the NO, MDA levels, increased SOD activity.

Asthma; Moxa cone moxibustion; Airway inflammation; Antioxidant

謝玲玲(1987-)，女，廣西崇左人，主治醫師，醫學碩士，從事針灸防治哮喘的臨床與研究。

R245.81

B

1006- 3250(2017)07- 0992- 03

2017- 01- 11